[发明专利]一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法

说明书

本发明涉及一种提高赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的分子改造方法；是在赖氨酸脱羧酶分子LDC的一端连接一段多肽片段EK。包括(1)获得赖氨酸脱羧酶分子的基因片段；(2)将编码EK多肽的基因片段连接到赖氨酸脱羧酶基因的一端；(3)将连接有EK多肽基因的赖氨酸脱羧酶基因连接到表达载体上，转入到宿主中，表达改造后的赖氨酸脱羧酶LDC‑EK。本发明通过对酶分子进行理性的改造，避免了随机突变的不确定性和繁琐的筛选过程；改造后的赖氨酸脱羧酶具有良好的稳定性和催化活性。LDC‑EK催化活性提高2倍，能够在较宽的温度范围内保持较高的活性，并且能够耐多种有机溶剂。方法更易操作，改造后蛋白更易制备。

技术领域

本发明涉及一种对赖氨酸脱羧酶(LDC)蛋白分子的改造方法。更具体的说，本发明涉及一种通过在赖氨酸脱羧酶的C端和(或)N端，连接赖氨酸(K)和谷氨酸(E)交替排列的多肽片段EK片段，来对赖氨酸脱羧酶修饰以提高其活性和稳定性的方法。

背景技术

1，5-戊二胺又名尸胺，是一种线性五碳二胺。可以广泛应用于多种商业用途，如合成聚酰胺、杀真菌剂、石油和燃料添加剂、树脂、螯合剂、沥青等，是一种重要的石油化工产品。化学法合成戊二胺依赖石油等不可再生资源，且污染较为严重，弊端很多。相比之下，生物合成法可利用环境友好型可再生资源生产戊二胺，越来越多的受到人们的关注。在生物法合成戊二胺中，赖氨酸脱羧酶是反应代谢的关键核心酶，它能够催化赖氨酸脱羧产生戊二胺。但是，野生型赖氨酸脱羧酶的稳定性较差，不耐高温，不耐碱。在发酵过程中，发酵液中不断积累戊二胺，使得发酵液pH逐步升高，此时赖氨酸脱羧酶的活性会受到很大抑制。蒋承建等生物酶法合成1，5-戊二胺的研究进展(广西科学，2017)。

为了提高赖氨酸脱羧酶的稳定性，研究者做出了多种尝试：酶的随机突变、固定化、定向进化等。Park等通过共价结合的方法，将赖氨酸脱羧酶制备成交联酶聚集体(CLEA)，提高了该酶的热稳定性，但是没有对酶的其他耐受性进行深入的探究；Chen Wang等对赖氨酸脱羧酶进行了定向进化研究，提高了其催化效率和活性；Fengyu Kou等对赖氨酸脱羧酶进行了定点突变研究，突变T88位置的氨基酸，突变体展现出了较高的温度、pH稳定性和催化活性。

除上述方法之外，通过在酶蛋白分子上连接聚合物或者多肽来对蛋白质分子进行改造也是一种重要的蛋白稳定方法，但是这种方法目前还没有应用于赖氨酸脱羧酶分子。目前，研究最为广泛的是PEG(聚乙二醇)修饰法，即在酶蛋白分子上连接PEG聚合物片段，以此来提高酶蛋白分子的稳定性。但是，这种方法改造的蛋白质不易生产，且会降低酶蛋白的生物活性和生物可降解性。为了克服PEG修饰所带来的缺陷，近年来又有多种对蛋白质修饰的聚合物被研究者提出，其中最具有应用前景的就是两性离子聚合物。Park S H等Cadaverine production by using cross-linked enzyme aggregate of Escherichiacoli lysine decarboxylase(Journal of Microbiology&Biotechnology.2017,27(2)289-296)。在前期研究中，两性离子聚合物(如聚羧基甜菜碱pCB，聚磺基甜菜碱pSB等展现出了优异的特性——超亲水、超低的生物黏附、超低的免疫原性、对蛋白质具有良好的稳定性，是PEG的优良替代物。研究者发现，将pCB连接到蛋白质的表面，能够在不影响功能的基础上，增加其稳定性。将pCB连接到模式酶——胰凝乳蛋白酶表面，大大提高了酶分子的温度稳定性和化学稳定性，并且增加了该酶对于底物的亲和力。