[发明专利]沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物及其富集分离试剂盒

权利要求书

1.一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将沙门氏菌噬菌体LPST10活化；

2）将磁珠进行羧基活化,得到活化羧基磁珠，所述羧基磁珠的直径为400nm；

3）将活化的噬菌体LPST10与羧基磁珠进行偶联，得到沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物；

所述沙门氏菌噬菌体为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimuriumbacteriophage)LPST10，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016473；

所述步骤2）中，磁珠羧基活化的方法如下：

取1mL保存磁珠，经超声分散充分混匀后，取100μL PuriMag Si-COOH磁珠到1.5mL离心管中，置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，保留磁珠；加入200μL MES溶液到上述离心管中，混匀置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，重复该步骤1次； 迅速加入新配置的100μL NHS溶液，200μL EDC溶液到装有磁珠的离心管中，漩涡混匀使磁珠充分悬浮，室温下垂直混合30min，用磁力架弃上清，并用冰PBS缓冲液洗三次，于100μLPBS缓冲液中重悬；

所述步骤3）中，偶联的方法为：

取100μL PBS缓冲液重悬保存活化的磁珠，加入10⁹PFU/ml的100μL噬菌体液轻柔地混匀，在4℃条件下垂直混合过夜，用1mL PBS缓冲液至少洗三次以去除未偶联的噬菌体，噬菌体-磁珠用1mL含0.1％BSA的PBS缓冲液封闭剩余结合位点，涡旋30s，将离心管置于混合仪4℃反应2h，反应结束后，将离心管置于磁力架上，待固液分离后移除上清液，然后加入1mLPBS缓冲液，磁吸分离，重复该步骤1次；噬菌体磁珠偶联物保存于含有质量体积浓度为0.1％的BSA的PBS缓冲液中。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，噬菌体LPST10活化的具体方法如下：

从-80℃取噬菌体贮存液于TSA平板上划线，按稀释倍数从高到低的方向倒入4mL含有200μL宿主菌的0.7％琼脂TSB培养基，挑取单个噬菌斑于1mL TSB培养基37℃培养6-8小时，加入20μL氯仿，继续培养10min以释放子代噬菌体；经8000r/min离心10min,取上清液划线，按上述方法采用双层平板于37℃培养，倾注4mL PBS缓冲液至含有噬菌斑的平板上于4℃过夜，吸取出缓冲液到10mL离心管，8,000rpm离心15min，并用0.22μm微孔滤膜过滤备用。

3.权利要求1或2所述的制备方法制备得到的沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物。

4.一种富集分离沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求3所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物、阴性对照品、阳性对照品、TE缓冲液；

其中，所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物溶于含有质量体积浓度为0.1％BSA的PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；其中，缓冲液中，沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的浓度为1～2μg/μL；

阴性对照品为含有质量体积浓度为0.1％BSA的PBS缓冲液，其中，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；

阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028；

TE缓冲液成分：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA。

5.利用权利要求4所述试剂盒富集分离沙门氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）当样品中含有沙门氏菌时，按噬菌体纳米磁珠偶联物与样品体积比1:5将样品加入噬菌体纳米磁珠偶联物中，于旋转涡旋仪上，37℃条件作用15min；

2）将样品置于磁力架上2-3min使磁珠充分吸附后，弃上清；所剩余磁珠偶联物于200μLTE缓冲液中重悬。