[发明专利]一种催化合成米格列醇中间体的转化菌株及方法

说明书

本发明公开了一种催化合成米格列醇中间体的转化菌株及方法，所述转化菌株由出发菌株ZJB16009经转化重组表达质粒pBBR‑sldAB后，再经筛选获得，命名为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，株号pBBR‑sldAB，保藏号为CCTCC No.M 2019033，其N‑羟乙基葡萄糖胺脱氢酶活力较出发菌株ZJB16009有较大提升，且时空产率约为出发菌株ZJB16009的2倍，显示了本发明氧化葡糖杆菌pBBR‑sldAB在米格列醇关键中间体6NSL的催化合成中具有较高的潜在应用价值。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种催化合成米格列醇中间体的转化菌株及方法。

背景技术

米格列醇[1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，miglitol]，为葡萄糖结构类似物(如式Ⅰ所示)，是德国拜耳(Bayer)公司开发的一种新型α-糖苷酶抑制剂类降糖药物，其对胰淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有高亲和力，能够抑制二糖、多糖和复合糖的水解，延缓葡萄糖和其它单糖的吸收，降糖效果明显，毒副作用明显低于磺酞脉类及双肌类药物，已经成为治疗II型糖尿病的重要治疗药物之一。

专利US4246345，US4806650，US5401645等公开了以N-羟乙基葡萄糖胺为底物用化学生物组合法合成米格列醇的工艺路线是目前合成米格列醇的主要技术路线，该底物由葡萄糖和乙醇胺经一步化学加氢过程合成，引入氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)对底物N-羟乙基葡萄糖胺进行4-羟基的选择性不对称氧化，获得的中间产物直接耦合化学加氢环化合成米格列醇。该工艺较传统的全化学合成具有合成工艺路线短，成本低，产量较高的优势。其中，氧化葡糖杆菌不对称选择性氧化是该路线的关键限制步骤。

国内外研究尽管已有制取米格列醇中间体的菌株，特别是氧化葡糖来源菌株的相关报道，如专利申请CN101302549A，CN105968042A，CN104693109A等，但由于氧化葡糖杆菌发酵单位的菌体量少，野生菌株N-羟乙基葡萄糖胺脱氢酶的活力相对较弱，对底物N-羟乙基葡萄糖胺的耐受性较差。催化进程较慢，底物浓度及转化率较低，如CN101029321A中所用的N-羟乙基葡萄糖胺的浓度在40g/L，限制了米格列醇的生产水平，亟需建立高山梨醇脱氢酶活力的菌株。此外，通过氧化葡糖杆菌的细胞固定化或者多次静息细胞多次套用策略(CN101270378A)能够在一定程度上提高单位细胞的产率，但是静息细胞对底物N-羟乙基葡萄糖胺的选择脱氢的比酶活力没有显著提高，单批次底物投料在50g/L及以下(Hu,ZC.,Bu,JL.,Wang,RY.et al.Appl Biochem Biotechnol(2018).https://doi.org/10.1007/s12010-018-2924-y)。专利CN108441491A通过建立米格列醇关键中间体6-脱氧-6-氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖(6NSL)的快速定量检测方法，结合诱变筛选获得了高活力催化合成米格列醇中间体6NSL菌株ZJB16009，底物浓度提升至60-80/L，如果进一步提高底物浓度，会显著降低产物6NSL的得率。前期文献报道了中间体6-脱氧-6氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖(6NSL)的异构化及其稳定性会显著影响米格列醇的最终产率(J.Org.Chem.2009,74,1766–1769)。因此，提高氧化葡糖杆菌对底物N-羟乙基葡萄糖胺的脱氢酶活力及全细胞合成关键中间体6NSL的时空产率是提升米格列醇生物转化工艺的关键策略。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种催化合成米格列醇中间体时空产率更高的转化菌株，用于催化N-羟乙基葡萄糖胺合成6-脱氧-6氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖。