[发明专利]一种评估细胞因子对EBV-LMP2特异性CTL免疫增强效果的实时监测体系

说明书

本发明“一种评估细胞因子对EBV‑LMP2特异性CTL免疫增强效果的实时监测体系”，属于细胞体外培养领域。所述实时监测体系可实时连续动态监测IL‑2和IL‑21对T细胞介导的细胞毒性的免疫增强效果。该方法检测结果显示：IL‑2浓度为60U/mL、IL‑21浓度为10ng/mL时，对EBV‑LMP2特异性CD8⁺T细胞的杀伤效率增强效果最高；单独添加终浓度为10ng/mL的IL‑21即可获得显著的免疫增强效果。结果表明，RTCA可用于实时监测IL‑2和IL‑21对T细胞功能的免疫增强效果。

技术领域

本发明涉及白细胞介素(Interleukin，IL)和T细胞体外培养领域，具体涉及到利用实时细胞分析技术(Real-time cell analysis)实时监测IL-2和IL-21对EBV-LMP2特异性CD8+T细胞杀伤效率的免疫增强效果。本发明还涉及到该检测方法的建立和应用。

背景技术

NPC的发生与EBV感染密切相关，EBV在NPC细胞中仅表达亚免疫优势的EBNA1、LMP1和LMP2，其中LMP2无致癌性且在所有NPC细胞中均表达，可诱导有效的细胞免疫应答，被公认为是NPC免疫治疗策略开发的理想靶标。目前，国内外诸多报道表明，EBV-LMP2特异性T细胞的过继转移治疗NPC患者，可在患者体内显著增强LMP2特异性CD8+CTL应答。EBV-LMP2特异性T细胞的过继转移疗法，需要在体外大量扩增LMP2特异性CD8+T细胞，但EBV-LMP2的免疫原性较弱且EBV-LMP2特异性CD8+CTL细胞在患者体内的频率较低，这极大限制了该治疗策略的研究与应用。此外，迄今为止体外T细胞培养在很大程度上是经验性的个体实验室特异性过程，导致实验结果的不一致。

CD8+T细胞是控制病毒感染和清除肿瘤细胞的关键效应细胞之一。EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)已被成功用于治疗EBV相关移植后淋巴增生性疾病(PTLD)超过二十年，但对于EBV阳性实体瘤，如鼻咽癌(NPC)的疗效有限。目前，EBV-LMP2特异性CTL的过继转移疗法或靶向EBV-LMP2免疫接种在患者体内诱生LMP2特异性CD8+CTL应答，是NPC免疫治疗策略的研究热点。EBV-LMP2的免疫原性较弱，且在患者体内的频率较低，限制了靶向EBV-LMP2免疫治疗策略的开发及其临床疗效。

细胞因子(Interleukin，IL)对T细胞的体外扩增、分化和体内的抗肿瘤活性等具有重要作用。CD8+T细胞培养通常使用IL-2，是体外幼稚T细胞的分化和生长因子，但IL-2的最佳浓度还没有系统性确立。高浓度的IL-2会促使T细胞非特异性增殖并发生细胞凋亡，不能用于T细胞的长期培养。使用MHC-肽四聚体染色和细胞内细胞因子染色法检测发现，许多抗原特异性T细胞在高浓度IL-2条件下扩增时已经失去功能。此外，γc家族细胞因子，如IL-7、IL-15、IL-21等可能发挥更强、更持久的扩增T细胞能力。其中，IL-21是IL-2细胞因子家族的新发现的成员，由活化的CD4+T细胞分泌，可促进CD8+T细胞的增殖和功能、增强其细胞毒活性。因此，IL-21有望在T细胞的体外培养体系中降低IL-2的用量或替代IL-2。

目前，IL-2、IL-21的最佳浓度还没有系统性确立，IL-2和IL-21对EBV-LMP2特异性CD8+CTL介导的细胞毒性的免疫增强效果仍有待进一步阐明。

因此，本领域亟需建立一种评估IL-2和IL-21对EBV-LMP2特异性CD8+CTL杀伤效率的免疫增强效果的检测方法。

发明内容

本发明的目的，建立一中可评估IL-2和IL-21对EBV-LMP2特异性CD8+CTL介导的细胞毒性的免疫增强效果的检测方法，同时明确EBV-LMP2特异性CD8+T细胞体外培养体系中IL-2和IL-21的最佳添加浓度，并比对分析IL-2和IL-21对LMP2特异性T细胞的免疫增强效果，为阐明上述特异性T细胞的体外培养体系中添加的IL种类及其最适浓度提供支持。