[发明专利]鉴定冬瓜杂种种子纯度的SSR分子标记引物及其应用

权利要求书

1.一种鉴定冬瓜杂种种子纯度的SSR分子标记引物，其特征在于：所述冬瓜杂种种子的母本为黑皮冬瓜类，父本为绿皮节瓜类或黑皮节瓜类；所述SSR分子标记引物上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的SSR分子标记引物在鉴定冬瓜杂种种子纯度中的应用，其特征在于：所述冬瓜杂种种子的母本为黑皮冬瓜类，父本为绿皮节瓜类或黑皮节瓜类。

3.使用权利要求1所述的SSR分子标记引物鉴定冬瓜杂种种子纯度的方法，其特征在于，步骤如下:

(1)提取冬瓜父母本和杂种种子的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，以SSR分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

(3)将电泳产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

(4)观察电泳检测结果，将父母本与杂交种子的带型进行对比，父本具有1条共显性特征带和1条显性特征带，母本具有1条共显性特征带，同时具有父母双亲本的3条特征带的种子鉴定为真正的杂交种，缺少父本或母本特征带的均视为假杂种，种子的纯度按如下方法计算：

杂种纯度＝检测到的真杂交种个数/种子检测总数×100％。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中以CTAB法提取冬瓜父母本和杂交种子的DNA。

5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)的PCR扩增程序为：95℃5min，95℃30s，56℃45s,72℃1min30s循环35次，72℃7min，终止。

6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法为：

①制备凝胶：用洗涤剂洗净一块平板和一块凹板,晾干备用；用70％乙醇将平板和凹板擦拭干净；用夹子夹好两板，平放在水平面上；配制40ml胶液，轻轻摇匀，并缓慢注入两块玻璃板的空隙处，灌满，保持注入溶液的连续性，若有气泡要及时去除；将点样梳插入玻璃板，注意去除气泡，且不要将梳子全部插入；室温下放置，丙烯酰胺开始聚合，1.5h后凝胶聚合完毕；

②电泳：在上下电泳槽内加入0.5×TBE,小心取出点样梳，用微量上样器上样，上样量0.8μl，接上电极，开启电源，230v恒压电泳80min；倒弃电泳缓冲液，取下玻璃板于工作台上，用单面刀片从两板底部轻轻撬起凹板，将平板放入大塑料皿内进行染色；

③银染：包括固定、冲洗、染色、水洗、显影、冲洗步骤：

固定：在1340ml蒸馏水中加入150ml无水乙醇，10ml冰醋酸，配好固定液；将平板放入，固定5min，直至指示剂消失；

冲洗：用蒸馏水漂洗凝胶2次，每次2min；凝胶从水中取出后，控水10～20s；

染色：在1500ml蒸馏水中加入1.5g硝酸银，配好染色液；将凝胶转入染色液中，缓慢摇动，染色8min；

水洗：将染好色的凝胶放入蒸馏水中冲洗10s，迅速取出控水；

显影：在1500ml蒸馏水中加入22.5g氢氧化钠，6ml甲醛，配好显影液；把凝胶放入显影液中，缓慢摇动10min以上，直到条带显现为止；

冲洗：用蒸馏水漂洗凝胶2min，置于室温下自然晾干。

7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：在步骤(4)中，父本具有1条共显性特征带和1条显性特征带，母本具有1条共显性特征带，其中父母本的共显性特征带为270bp或280bp，父本的显性特征带为240bp或320bp。