[发明专利]一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法在审
| 申请号： | 201910162451.8 | 申请日： | 2019-03-05 |
| 公开（公告）号： | CN109749948A | 公开（公告）日： | 2019-05-14 |
| 发明（设计）人： | 李洪波;张天琪;毕日秀;吴泽慧 | 申请（专利权）人： | 天津科技大学 |
| 主分类号： | C12N1/19 | 分类号： | C12N1/19;C12N15/81;C12N9/10;C12R1/84 |
| 代理公司： | 天津盛理知识产权代理有限公司 12209 | 代理人： | 韩晓梅 |
| 地址： | 300457 天津市滨*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组毕赤酵母菌株 谷氨酰胺转氨酶 黏玉米 谷氨酰胺转氨酶基因 巴斯德毕赤酵母 醇氧化酶启动子 翻译延伸因子 基因工程菌株 重组表达载体 重组菌株 能力强 启动子 调控 成环 分泌 构建 酶活 替换 转入 基因 应用 | ||
1.一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，其特征在于：所述重组毕赤酵母菌株为将来源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase)基因转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中得到的基因工程菌株，该重组毕赤酵母菌株是通过将pPIC9K质粒中的醇氧化酶启动子PAOX1替换成翻译延伸因子1-α启动子PTEF1，并与谷氨酰胺转氨酶基因连接成环，构成重组表达载体的方式得到的。
2.根据权利要求1所述的利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，其特征在于：所述谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，其特征在于：所述PTEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1至3任一项所述的利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，其特征在于：所述重组毕赤酵母菌株的宿主为P.pastoris GS115。
5.如权利要求1至4任一项所述的重组毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴获得来源于黏玉米的谷氨酰胺转氨酶基因与启动子PTEF1序列；
⑵将pPIC9K质粒载体与谷氨酰胺转氨酶基因连接，获得含有黏玉米谷氨酰胺转氨酶基因的重组质粒pAOX9k-tgz；
⑶启动子PTEF1进行Sac I和Bam HI双酶切并定向插入同样经Sac I和Bam HI双酶切的重组质粒pAOX9k-tgz中，获得重组载体pTEF9k-tgz；
⑷将步骤⑶得到的重组载体pTEF9k-tgz转化到宿主中，获得重组毕赤酵母菌株。
6.如权利要求1至4任一项所述的重组毕赤酵母菌株生产黏玉米来源谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于：步骤如下：
将重组毕赤酵母接种于YPD培养基中，25-30℃，210-260r/min活化培养20-27h后，得活化的培养液，再将活化的培养液转接至发酵体系中，发酵生产谷氨酰胺转氨酶。
7.根据权利要求6所述的重组毕赤酵母菌株生产黏玉米来源谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于：按10％的接种量将活化的培养液转接到BMGY培养基中，每24h加入甘油，使其体积终浓度为2％，发酵时间为96h，即得谷氨酰胺转氨酶。
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