[发明专利]一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法

说明书

本发明涉及一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株为将来源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase)基因转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中得到的基因工程菌株，该重组毕赤酵母菌株是通过将pPIC9K质粒中的醇氧化酶启动子P_AOX1替换成翻译延伸因子1‑α启动子P_TEF1，并与谷氨酰胺转氨酶基因连接成环，构成重组表达载体的方式得到的。本重组菌株易于培养、分泌能力强，利于谷氨酰胺转氨酶的大量表达，酶活可达479mU/mL，具有安全可靠的特点，且具有重要的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法，更具体地为重组质粒pTEF9k-tgz的构建和通过启动子P_TEF1调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶在巴斯德毕赤酵母中的表达。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13)是一种催化酰基转移反应的酶，它能催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基(氨基受体)和赖氨酸残基的ε-氨基或其它伯胺基(氨基供体)之间的酰基转移反应。TGase的这种催化作用改变了蛋白质的构象，实现了蛋白质分子内、分子间的交联，从而改善了蛋白质的功能性质。

TGase广泛分布于动物、植物和微生物的机体组织中。20世纪50年代，豚鼠肝脏TGase(Guinea pig transglutaminase,GTG)是商业酶的主要来源，但其来源稀少、分离纯化工艺复杂，导致酶的价格较高，使其在食品工业中的应用面临一定的困难。随后，研究者分离纯化了微生物来源的TGase(MTG)，由于该酶可以利用微生物发酵法大规模生产，所以MTG最终实现了商业化生产。

与动物和微生物来源TGase相比，研究者对植物来源TGase的研究较少。植物TGase主要分布于植物的细胞质、细胞壁、叶绿体和线粒体等亚细胞区室，可能与植物组织中的能量转移、细胞骨架形成有关。但是由于从植物组织中提取TGase的分离纯化工艺复杂，产量较低，限制了其进一步的应用和研究。目前利用基因工程技术将黏玉米来源TGase(TGZ)基因在大肠杆菌、毕赤酵母等异源宿主中表达已成为新的趋势。然而，总体来说构建的菌株产酶量低、稳定性差、生产成本较高，与商业化生产仍有一定的差距。因此，如何在表达体系中稳定、高效地直接表达活性谷氨酰胺转氨酶，是当前植物来源谷氨酰胺转氨酶研究的一个趋势，对于该酶的应用研究具有重要意义。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，该重组菌株易于培养、分泌能力强，利于谷氨酰胺转氨酶的大量表达，酶活可达479mU/mL，利用毕赤酵母为宿主发酵得到的谷氨酰胺转氨酶具有安全可靠的特点，且具有重要的应用前景。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种利用TEF1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株为将来源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase)基因转入巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中得到的基因工程菌株，该重组毕赤酵母菌株是通过将pPIC9K质粒中的醇氧化酶启动子P_AOX1替换成翻译延伸因子1-α启动子P_TEF1，并与谷氨酰胺转氨酶基因连接成环，构成重组表达载体的方式得到的。

而且，所述谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

而且，所述P_TEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。