[发明专利]一种利用FLD1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法

说明书

本发明涉及一种利用FLD1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株为将来源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase)基因转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中得到的基因工程菌株，该重组毕赤酵母菌株通过将pPIC9K质粒中的醇氧化酶启动子P_AOX1替换成甲醛脱氢酶启动子P_FLD1，并与谷氨酰胺转氨酶基因连接成环，构成重组表达载体的方式得到的。本重组菌株易于培养、分泌能力强，利于谷氨酰胺转氨酶的大量表达，具有安全可靠的特点，且具有重要的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是一种利用FLD1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法，更具体地，为重组质粒pFLD9k-tgz的构建和通过启动子P_FLD1调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶在巴斯德毕赤酵母中的表达。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13)是一种通过催化谷氨酰胺残基和赖氨酸残基之间的酰基转移反应，形成赖氨酸异肽键，从而实现蛋白质分子内、分子间交联的酶。TGase在不改变产品风味和颜色的前提下可以改善食品的凝胶性、溶解性、乳化性、发泡性和持水力。同时这种交联反应可以将必需氨基酸转移到蛋白质，从而提高蛋白质的营养价值。

TGase在食品、生物医学、纺织等方面有着广阔的应用前景，而且TGase是被食品药品监督管理局和其他科学界认可的人类摄入安全的物质。酪蛋白，大豆球蛋白，谷蛋白，肌原纤维蛋白等食物蛋白质都是TGase的良好底物，因此其在食品行业的应用最受关注，这也进一步增加了对廉价、有效和安全TGase的需求。

植物来源TGase主要分布于植物的细胞质、细胞壁、叶绿体和线粒体等亚细胞区室，可能与植物组织中的能量转移、细胞骨架形成有关。植物来源TGase的分离纯化工艺复杂，同时数据库中缺少相应的氨基酸和基因序列信息，这些共同阻碍了植物来源TGase的研究。目前已获得拟南芥、黏玉米、菊芋、稻子、梨及苹果TGase的基因序列，研究者也已陆续将拟南芥和黏玉米TGase进行异源表达。但是构建的基因工程菌株的产酶量较低，限制了植物来源TGase的应用研究。因此，进一步提高表达水平，获得高活性谷氨酰胺转氨酶重组菌株，是目前亟待解决的问题。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用FLD1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，该重组菌株易于培养、分泌能力强，利于谷氨酰胺转氨酶的大量表达，本发明利用毕赤酵母为宿主发酵得到的谷氨酰胺转氨酶具有安全可靠的特点，且具有重要的应用前景。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种利用FLD1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株为将来源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase)基因转入巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中得到的基因工程菌株，该重组毕赤酵母菌株通过将pPIC9K质粒中的醇氧化酶启动子P_AOX1替换成甲醛脱氢酶启动子P_FLD1，并与谷氨酰胺转氨酶基因连接成环，构成重组表达载体的方式得到的。

而且，所述谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

而且，所述P_FLD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

而且，所述重组毕赤酵母的宿主为P.pastoris GS115。

如上所述的重组毕赤酵母菌株的构建方法，步骤如下：