[发明专利]一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法

权利要求书

1.一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法包括以下步骤：

第一步，健康人头皮中DPC和ORSC的分离培养；

第二步，DPC-Exos的分离和鉴定；

第三步，DPC-Exos经皮注射小鼠背部；

第四步，组织形态学和免疫组化分析；

第五步，细胞增殖试验；

第六步，通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析；

第七步，通过划痕实验和Transwell实验对ORSC进行愈合和迁移能力检测；

第八步，RT-PCR检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh基因表达水平；

第九步，Western Blot检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh蛋白表达水平；

第十步，统计分析。

2.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第一步的健康人头皮中DPC和ORSC的分离培养具体包括：

从没有全身性疾病且正在接受整形手术的患者知情情况下获得健康人头皮标本；通过两步酶消化法从头皮HF中分离出ORSC和DPC；头皮沿真皮-表皮交界处偏下剪开，浸泡于dispase，4℃过夜，将HF拔出后放入胰酶消化5-10分钟；经滤器筛后用预冷PBS洗涤ORSC悬浮液并以800×g离心5分钟，然后重悬于完全角质形成细胞培养基CKSFM中；将真皮部分由胶原酶37℃消化3-6小时，经滤器筛DPC由PBS洗涤并重悬于含有10％FBS的DMEM/F-12(1：1)中；将ORSC和DPC转移至25ml培养瓶中，并在37℃，5％CO₂的潮湿培养箱中培养。

3.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第二步的DPC-Exos的分离和鉴定具体包括：

当培养瓶中细胞长到70％-80％时，弃培养液用预冷PBS洗涤DPC两次，将培养基替换成不含外泌体的血清培养基，在37℃，5％CO₂下继续培养48小时。收集上清液以2000×g,4℃，离心30分钟，吸上清(留管底0.5-1cm液体)以10000×g离心30分钟，然后用0.22-μm过滤器过滤；收集到的液体上超离机，以100,000×g超离心2小时；将沉淀的外泌体重悬于15mLPBS中，以100000×g离心70分钟，弃上清，将沉淀(DPC-Exos)溶于100ulPBS中储存在-80℃直至使用；

通过qNano仪器上的TRPS确定DPC-Exo浓度和直径大小范围分布。通过透射电子显微镜观察外泌体形态；通过Western Blot检测细胞表面标志蛋白：CD9、CD63和TSG101。

4.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第三步的DPC-Exos经皮注射小鼠背部具体包括：

将雌性6-8周龄C57BL/6小鼠背部蜜蜡脱毛后随机分为：PBS对照组和DPC-Exos实验组；将100μl(1.0x10¹⁰/ml)DPC-Exos分别于休止期(脱毛后0天：p.d 0)和生长期VI期(p.d 12)经皮注射到C57BL/6小鼠的背部，对照组小鼠注射等体积PBS(100μl)；连续每日注射，在进入下一个HF生长周期阶段之前(分别在p.d 3和p.d 18)取材注射部位的皮肤毛囊组织样品。

5.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第四步的组织形态学和免疫组化分析具体包括：

将固定在4％多聚甲醛中的背部皮肤组织脱水包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片，用苏木素和伊红染色，根据毛囊长度、毛球部直径、HF百分比和毛发周期评分以及皮肤厚度这四个参数评估HF生长及周期；每组至少分析50个HF；免疫组化染anti-β-catenin和anti-shh。