[发明专利]一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法

说明书

本发明属于细胞分泌物提取技术领域，公开了一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体(DPC‑Exos)提取方法；通过可控电阻式脉冲感应(TRPS)分析、电镜、WesternBlot鉴定DPC‑Exos；将DPC‑Exos加入离体培养的人毛囊外根鞘细胞(ORSCs)的培养基中。鉴定发现DPC‑Exos直径约为105nm，表达肿瘤易感基因(TSG)101，分化簇(CD)9和CD63；DPC‑Exos促进人ORSCs的增殖和迁移，并检测到ORSCs中β‑catenin和Sonichedgehog(Shh)的mRNA和蛋白质水平经处理后上调；经皮注射DPC‑Exos加速了小鼠HF生长期启动并延缓了退行期发生。免疫组织化学分析显示β‑catenin和Shh表达水平在实验组毛囊中上调。DPC‑Exos有助于调节HF的生长发育和生长周期，并为临床脱发的治疗提供了新的潜在途径。

技术领域

本发明属于细胞分泌物提取技术领域，尤其涉及一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法。

背景技术

毛囊毛乳头细胞(DPC)来源于毛囊(HF)间充质，在HF上皮-间充质相互交流中起关键作用。DPC被认为通过旁分泌机制调节HF生长发育，其中外泌体可能起重要作用。在雄激素性脱发中，毛发表现为HF变细软，毛球部变小，生长期变短，导致脱发。脱发十分影响外在形象、自信和生活质量，但目前FDA批准的药物主要有两种，内服的非那雄胺和外用的米诺地尔，随着用药停止，毛囊逐渐恢复并继续原先的脱发状态。而HF移植费用昂贵且来源有限。因此需要更有效和新颖的治疗方法。

HF上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用对HF生长发育和周期调控起着十分关键的作用。这种相互作用不仅对胚胎发育过程中的分化很重要，而且对成人HF细胞增殖和迁移的调节也很重要。DPC来源于间充质，ORSC来源于上皮，是HF发育和生长的关键调节因子。作为一种特殊的间充质细胞，DPCs不仅可以促进HF上皮功能，调节HF的发生、生长和周期循环，还参与脱发的发病机制。有研究报道，DPC调节ORSC的增殖和迁移，并调节ORSC的分化以及HF特异性结构和功能。

近期报道表明，DPC主要通过旁分泌机制发挥其对HF生长的调节作用。DPC释放各种因子，包括表皮生长因子，转化生长因子-β和角质形成细胞生长因子，以刺激毛囊上皮细胞的增殖和分化，并调节间充质-上皮相互作用。

外泌体是纳米级小囊泡，是旁分泌信号传导的重要组成部分。外泌体几乎由各种类型的细胞分泌，内含蛋白质、mRNA和microRNA等，能够促进细胞间交流。来自间充质干细胞的外泌体(MSC-Exos)已被证明可刺激皮肤成纤维细胞的增殖和迁移并调节瘢痕形成；由角质形成细胞释放的外泌体影响黑素细胞色素沉着；而来自人羊膜上皮细胞的外泌体可促进伤口愈合。基于这些研究结果，我们推测DPC分泌的分泌物(外泌体)在HF生长和发育中具有调节作用，目前国内外尚未发表相关文献。

综上所述，现有技术存在的问题是：DPC分泌的外泌体在HF生长和发育中是否具有调节作用尚未被研究过。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法。

本发明是这样实现的，一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法包括以下步骤：

步骤一，健康人头皮中DPC和ORSC的分离培养；

步骤二，DPC-Exos的分离和鉴定；

步骤三，DPC-Exos经皮注射小鼠背部；

步骤四，组织形态学和免疫组化分析；

步骤五，细胞增殖试验；

步骤六，通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析；

步骤七，通过划痕实验和Transwell实验对ORSC进行愈合和迁移能力检测；