[发明专利]一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法与应用

权利要求书

1.一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法，其特征在于，利用含有庆大霉素抗性基因的自杀质粒pJQ200SK构建用于基因敲除的重组载体，将重组载体转入接合用S17-1λpir感受态细胞中，通过接合的方式将重组载体转入到具有利福平抗性的OH23中，并在含利福平和庆大霉素抗性培养基上进行一次交换子，进而通过pJQ200SK载体所带的sacB蔗糖致死基因进行二次交换子的筛选，再利用PCR进行突变体筛选获得基因敲除突变体。

2.根据权利要求1所述的一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法，其特征在于，所述自杀质粒为质粒pJQ200SK。

3.根据权利要求1所述的一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，构建重组载体

设计目的基因上游臂引物和下游臂引物，利用PCR扩增目的基因的上下游同源臂；将自杀质粒与上下游同源臂利用相应的内切酶进行酶切并连接得到用于基因敲除的重组载体；将重组载体以电转化方式转入S17-1λpir感受态细胞中，将细胞涂布于含庆大霉素抗性培养基上培养，至于37℃静置培养，进而获得含有重组载体的S17-1λpir大肠杆菌；

步骤2，重组载体转入变棕溶杆菌OH23

挑取含有重组载体的S17-1λpir大肠杆菌和变棕溶杆菌OH23单菌落分别在LB培养基和NBWS培养基中活化，待生长至OD₆₀₀≈0.6-0.8，分别取2 mL菌液离心后，用无菌水清洗三次后，在无菌滤膜上进行接合；接合条件：37℃ 1 h后，正置放于28℃培养箱中培养12 h；将滤膜上的细胞涂布于含利福平和庆大霉素抗性培养基上；挑取单菌落进行PCR筛选一次交换子；

步骤3，构建基因敲除突变体

挑取一次交换子单菌落于NBWS培养基中进行二次交换培养；取上述二次交换培养液涂布于复配质量分数4%蔗糖的NAWS平板培养基，筛选二次交换子；挑取转化子进行PCR验证，获得基因敲除突变体。

4.根据权利要求3所述的一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法，其特征在于，步骤1中所述含庆大霉素抗性培养基为含20 μg/mL庆大霉素的LB平板。

5.根据权利要求3所述的一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法，其特征在于，步骤2中所述含利福平和庆大霉素抗性培养基为含20 μg/mL利福平和8 μg/mL庆大霉素的NAWS平板。

6.根据权利要求3所述的一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法，其特征在于，步骤3中所述二次交换培养的条件为：28°C，180 rpm培养7 h。

7.根据权利要求3所述的一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法，其特征在于，所述NBWS培养基为不含蔗糖的NB培养基；所述NAWS平板培养基为不含蔗糖的NA固体培养基；所述NA固体培养基为1 L NB培养基，17g琼脂；所述LB培养基的配方为：10g蛋白胨，5 g 酵母粉，10 g氯化钠，pH 7.0-7.2，1 L灭菌水；所述NB培养基的配方为：3 g牛肉膏，1 g 酵母粉，5 g蛋白胨，10 g蔗糖，pH 7.0-7.2，1 L灭菌水。

8.基于权利要求1所得的基因敲除突变体在小分子代谢产物生物合成或研究遗传调控好作用机制上的应用。