[发明专利]一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法与应用，属于微生物基因工程技术领域。本发明利用自杀质粒构建用于基因敲除的重组载体，将重组载体转入S17‑1λpir感受态细胞中，通过接合的方式将重组载体转入到变棕溶杆菌中，并在含庆大霉素抗性培养基上和含蔗糖培养基上分别进行一次交换子和二次交换子的筛选，再利用PCR进行突变体筛选获得基因敲除突变体。利用该敲除系统成功敲除变棕溶杆菌OH23中的两个基因，证明该系统适用于抗生素溶杆菌的基因功能研究，为其小分子代谢产物生物合成、遗传调控和作用机制研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法与应用。

背景技术

溶杆菌广泛存在自然界中，分类地位上属于黄单胞科（Xanthomonadaceae），溶杆菌属（Lysobacter），能够产生多种胞外水解酶和小分子抗菌物质，对农作物产生病害的细菌、真菌、卵菌及线虫产生显著的拮抗作用。

变棕溶杆菌OH23（Lysobacter brunescens）为本实验室分离于植物根际土壤一株革兰氏阴性细菌。OH23能够特异性的拮抗水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzae PXO99A）、水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae RS105）、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae KACC）、野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pathovars）、地毯草黄单胞菌大豆致病变种（Xanthomonas axonopodis pv.glycines）等黄单胞菌。由于溶杆菌对许多抗生素有抗性，且敏感的抗生素种类也不相同，导致溶杆菌的基因敲除系统不易构建，而且不同溶杆菌甚至同一个种的不同菌株其有效的基因敲除系统也不相同，不能共用。因此，针对变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建，有助于对OH23进行分子操作，特别是可为其小分子代谢产物生物合成、遗传调控和作用机制研究奠定基础。

发明内容

针对现有技术中变棕溶杆菌OH23的基因敲除系统不能共用的问题，本发明的目的在于提供一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法与应用，构建方法简单，有助于对OH23进行分子操作，尤其为其小分子代谢产物生物合成、遗传调控和作用机制研究奠定基础。

一种基于同源重组的变棕溶杆菌OH23基因敲除系统的构建方法，利用含有庆大霉素抗性基因的自杀质粒pJQ200SK构建用于基因敲除的重组载体，将重组载体转入接合用S17-1λpir感受态细胞中，通过接合的方式将重组载体转入到具有利福平抗性的OH23中，并在含利福平和庆大霉素抗性培养基上进行一次交换子，进而通过pJQ200SK载体所带的sacB蔗糖致死基因进行二次交换子的筛选，再利用PCR进行突变体筛选获得基因敲除突变体。

作为改进的是，所述的自杀质粒为质粒pJQ200SK。

作为改进的是，上述构建方法包括以下步骤：

步骤1，构建重组载体

设计目的基因上游臂引物和下游臂引物，利用PCR扩增目的基因的上下游同源臂；将自杀质粒与上下游同源臂利用相应的内切酶进行酶切并连接得到用于基因敲除的重组载体；将重组载体以电转化方式转入S17-1λpir感受态细胞中，将细胞涂布于含庆大霉素抗性培养基上培养，至于37℃静置培养，进而获得含有重组载体的S17-1λpir大肠杆菌；

步骤2，重组载体转入变棕溶杆菌OH23