[发明专利]DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用

说明书

本发明提供了DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用。所述DNA条形码来源于黑曲霉TMCC 70012菌株的基因组，并且包含选自如SEQ ID No.4所示的DNA序列中的至少500bp的序列，并且该DNA条形码的长度为500bp‑4000bp。本发明的DNA条形码序列能实现黑曲霉种内菌种的快速鉴别与区分。由此，本发明建立了普洱茶工业发酵生产菌株黑曲霉TMCC 70012的标准基因序列和样品鉴别方法，相比于传统的形态学鉴定方法，显著提高了鉴定效率。

技术领域

本发明属于物种和菌株鉴定领域，具体涉及一种用于鉴别普洱茶发酵生产菌株的DNA条形码引物组合物、DNA条形码、试剂盒、方法及应用。具体而言，所述普洱茶发酵生产菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)TMCC 70012。

背景技术

普洱茶是一种具有云南地理标识范围内生产的后发酵茶，其采用大叶种晒青毛茶作为原料，经过一系列工艺制作而成。传统的普洱茶制作过程为：采摘的新鲜茶叶经揉捻、晒青后制成原料晒青毛茶，之后经除杂、潮水、渥堆、晾干、筛分、压制成型、包装出厂。在普洱茶的生产中，渥堆发酵过程是普洱茶品质形成的主要因素，在此过程中，茶叶中诸如茶多酚、咖啡因以及一些多糖物质等内含成分发生了巨大变化，成就了普洱茶的特殊风味、口感、品质以及各种保健功效。

在传统的普洱茶生产中，湿热的环境激活茶叶本身所含的酶，使得茶叶中所含的一部分内含成分转化成微生物能利用的物质；普洱茶发酵过程中微生物也大量生长，产生丰富的胞内酶和胞外酶，催化茶叶中内含成分发生一系列转变，由此形成普洱茶独特的品质。不同的产地，微生物种类及其群落结构的差异，使得普洱茶风味及品质也各具特色。

普洱茶除了其独特的风味和文化外，其诸如减肥、降血糖和血脂、预防和改善心血管疾病、抗衰老、抗癌、消炎、助消化以及养胃等保健功效也备受人们关注，并越来越受消费者欢迎。逐渐增加的市场需求拉动了普洱茶产业的发展，促进了云南地区经济增长。

目前多数生产商的普洱茶生产仍然是半自然人工渥堆的经验式发酵，虽然渥堆过程中以包括黑曲霉(Aspergillus niger)在内的优势共性微生物为主的群落相对稳定，但产品的稳定性还存在较大的提升空间。要进一步获得消费者的青睐和市场的认可、突破外贸壁垒，提升普洱茶企业的市场竞争力，必须实现普洱茶生产的人工可控、清洁化以及高效化，并不断开发新产品、延伸产业链。要做到这些，就必须革新技术，发明一系列安全、清洁、高效、人工可控的自动化普洱茶新工艺，才能确保普洱茶产业的健康发展，给国家和人民带来长远利益。

人工接种和普洱茶的纯种发酵是普洱茶可控发酵的新发展方向。为保护普洱茶发酵工艺和优质微生物种质资源，开发对普洱茶发酵用菌种快速、精准鉴别方法势在必行。

DNA条形码技术可快速、简便地鉴别、区分与其相似菌种，可为普洱茶人工可控纯种发酵工艺开发和资源保护提供理论依据和技术手段，促进普洱茶产业健康发展。

发明内容

为克服形态学在鉴定普洱茶发酵生产菌上存在的缺陷，本发明提供了用于鉴别普洱茶发酵菌种黑曲霉(Aspergillus niger)TMCC 70012的DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用，从而可以准确地将黑曲霉TMCC 70012菌株从易混淆的物种或复合种中鉴别出来，实现进行快速鉴别和区分，可为普洱茶新发酵工艺提供快速鉴别、评估，防止发酵过程中其他杂菌的干扰，以及为普洱茶人工可控发酵工艺及菌种滥用提供举证方法和依据。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

(1)一种用于鉴别黑曲霉菌株的DNA条形码，该DNA条形码来源于黑曲霉TMCC70012菌株的基因组，并且包含选自如SEQ ID No.4所示的DNA序列中的至少500bp的序列，并且该DNA条形码的长度为500bp-4000bp，优选为500bp-900bp。