[发明专利]一种制备及纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒

权利要求书

1.一种制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，将病毒按MOI=5用PBS、DMEM-0或opti-MEM培养基作为病毒稀释液稀释后感染Vero细胞1-3h；然后吸弃病毒液，更换成含体积百分比为3-10%FBS的PBS、DMEM或opti-MEM完全培养基作为病毒扩增液，培养36-48h后收获病毒液。

2.根据权利要求1所述的一种制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：

S1、在培养板的N个孔中的N-1个孔中加入Vero-E6细胞（ATCC）悬液，体积为2mL，使细胞量达到4×10⁵个/孔，37℃，体积百分比5%CO2培养 16 h；

S2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数，其余孔的细胞分别按MOI=5将

病毒用DMEM-0作为病毒稀释液稀释至1mL并吸弃掉培养基，将经过细胞消化后的液体分别加入到其余孔中，在37℃，体积百分比5% CO2条件下感染1h-3h，其中所述病毒为弹状病毒科水疱性口炎病毒属，具备特异性杀伤肿瘤细胞特性，并且可以在Vero细胞中扩增和复制，具备反复侵染Vero细胞的能力；

S3、 吸弃病毒液，加入含体积百分比为3-10%FBS的DMEM完全培养基0.5-2mL作为病毒扩增液，在37℃、体积百分比5% CO2的条件下培养36-48h， 离心、并使用滤器进行过滤备用。

3.根据权利要求2所述的制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，其中S3中，吸弃病毒液，加入含体积百分比为3%的FBS的DMEM培养基0.75-1mL，在37℃、体积百分比5% CO2的条件下培养36h，收集病毒液2500rpm 离心15min，并使用0.22μm滤器进行过滤备用。

4.根据权利要求1所述的制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，所述病毒为重组溶瘤弹状病毒，选自水疱性口炎病毒。

5.根据权利要求1所述的制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，所述病毒为重组溶瘤弹状病毒，选自水疱性口炎病毒印第安纳株。

6.根据权利要求1所述的制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，所述病毒为重组溶瘤病毒，选自VSV MuddSummer亚型株。

7.一种纯化溶瘤病毒的方法，其特征在于，该方法根据权利要求1-6任一方法制备溶瘤病毒，其中，制备中所用的培养容器替换为适合贴壁细胞培养的反应器；制备中所用的病毒稀释液的体积及病毒扩增液的体积以等比例扩大，为制备中病毒稀释液的体积及病毒扩增液的体积的2.5-20倍；过滤后的上清在含3mL+30%蔗糖垫底下进行高速离心。

8.根据权利要求7所述的纯化溶瘤病毒的方法，其特征在于，所述高速离心为在 3 mL30%蔗糖垫底下30000×g高速离心1h。

9.根据权利要求7所述的纯化溶瘤病毒的方法，其特征在于，所述高速离心为为两步离心法：第一步：用3 mL 30%蔗糖垫底下26000×g离心1h，第二步：继续28000×g离心30-45min。

10.一种重组溶瘤弹状病毒，其特征在于，所述重组溶瘤弹状病毒根据权利要求1-9任一所述方法得到，所述重组溶瘤弹状病毒包含改性基质蛋白(M)，所述改性基因蛋白（M）与减毒弹状病毒的M蛋白同样存在可正常维持蛋白质的功能的保守突变，编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与减毒弹状病毒的M蛋白（SEQ ID NO：1所示）的氨基酸序列相比，具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，最优选至少98%相同的序列；并且，所述氨基酸序列和减毒弹状病毒的M蛋白（SEQ ID NO：1所示）相比，在第51位置、第221位置、第226位置同时具有氨基酸替换，或者编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与减毒弹状病毒的M蛋白（SEQ ID NO：1所示）所示的氨基酸序列相比，在第21位置、第51位置、第111位置和第221位置同时具有氨基酸替换。