[发明专利]一种制备及纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒

说明书

本发明公开了一种制备和纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒，该制备方法利用Vero细胞制备溶瘤病毒（特别是VSV病毒），首先利用Vero细胞优化病毒扩增条件，包括优化病毒感染复数（MOI）、病毒稀释液、病毒扩增液、扩增时血清浓度、细胞培养体积、病毒收获时间等条件；进一步通过优化病毒纯化条件，包括优化离心力、蔗糖垫底离心、离心时间、分步离心等条件，发现VSV病毒粒子在3%FBS培养基中，按MOI=5的比例感染Vero细胞48h，收获病毒液，在4℃、26000×g离心1h后，进行28000×g离心（30min‑45min）确定在分步离心条件下能稳定制备出高滴度的VSV病毒。该制备方法能高效、稳定、节约成本，为后续VSV病毒的规模化生产提供了技术支持，可用于制备抗肿瘤用的病毒药物。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种制备和纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒。

技术背景

Vero细胞是非洲绿猴肾脏细胞，是一种连续传代细胞系。该细胞的优点在于其质量和外源因子可控性高，繁殖速度快，能高密度生长，并具有微载体培养工艺化生产的优势，同时该细胞为干扰素分泌缺陷型细胞，因而对于病毒，如VSV病毒（水疱性口炎病毒）的复制影响较小，可扩增出高低度的病毒颗粒。Vero细胞可用于疫苗生产中的病毒培养基质细胞，1982年Vero细胞已被WHO批准可以用于人类疫苗的生产基质，如脊髓灰质炎疫苗和狂犬疫苗的生产。

癌症和常规的癌症治疗剂目前在情绪/身体痛苦、失去生命和增加医疗保健成本方面带来了显著的社会经济负担。常规的疗法显示出一些有益的临床效果但是伴随着产生降低患者的生活质量的毒副作用。临床治疗中需要有更有效的且更低的毒副作用的癌症疗法。

目前小分子药物、单克隆抗体等被开发应用于肿瘤的新型治疗，但治愈率不高，有待更多的研究。另外，仅用单一药物治疗可能会导致肿瘤细胞出现耐药性，因此急需开发有效的生物治疗方法。溶瘤病毒是一种通过遗传学改变而具有复制能力的病毒，经过高度稀释的减毒病毒能利用肿瘤(靶)细胞中抑癌基因的失活或缺陷，选择性地在靶细胞内复制，最终导致肿瘤细胞的溶解和死亡，而在正常细胞内它只是少量存在或不能增殖。利用这种病毒进行的肿瘤治疗称为溶瘤病毒治疗。溶瘤病毒不但自身在肿瘤细胞内复制，导致细胞溶解和死亡；而且通过死亡的细胞释放出病毒颗粒，产生一种级联效应，放大溶细胞效果，直至肿瘤细胞被清除。同时，肿瘤细胞的破裂会导致肿瘤抗原从肿瘤细胞中释放，从而诱导体内系统性的抗肿瘤免疫反应，这可能会增强病毒的溶细胞活性。溶瘤病毒进入肿瘤细胞后由于自我复制可陆续破坏宿主细胞，进而向周围扩散，进入其他肿瘤细胞。如此反复循环，可发挥有效的抗肿瘤效果。

随着 RNA 病毒遗传技术的进展，水疱性口炎病毒属载体已被开发成为一种有效的治疗制剂。VSV（水疱性口炎病毒）载体是一种高效的溶瘤弹状病毒载体，具有非常广的溶瘤范围。根据资料报道，VSV载体几乎能够侵染溶解所有的肿瘤细胞，在体外实验中VSV载体的溶瘤率都在50%以上，在体内实验中VSV载体能够显著延长荷瘤动物模型的寿命。VSV载体也被开发成为一种有效的疫苗载体，VSV载体作为疫苗载体应用到获得性免疫缺陷综合症病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和乙肝病毒等疫苗的研制过程中。因此水疱性口炎病毒载体具有非常好的应用前景。

VSV为弹状病毒科成员，是一种不分节段单股负链RNA病毒，病毒基因组长约11kb并且不会整合到宿主基因组内，主要以节肢动物为传播媒介，可感染大多数哺乳动物。在自然界中，VSV感染猪、牛和马，并在口和足附近导致水痘性疾病。尽管有报道表明VSV可感染人，但是VSV在人类中没有导致任何严重的症状。VSV编码5种蛋白，包括核壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、表面糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)。由VSV基质蛋白(M)阻断宿主细胞蛋白合成会诱导细胞死亡。

VSV病毒颗粒呈子弹状或圆柱状，长度约为直径的3倍（150-180nm×50-70nm），病毒粒子表面有囊膜，囊膜上均匀密布短的纤突，长约10nm。VSV病毒粒子分子量为265.6×103±13.3×103KD，其中蛋白占74%，类脂质占20%，糖类占3%，RNA占3%。