[发明专利]一类优化的人类白细胞介素-2基因及其表达方法和应用

说明书

本发明提供了一类优化的人类白细胞介素‑2基因及其表达方法和应用。本发明通过两步优化方法对人来源的IL‑2进行改造：密码子优化和氨基酸序列优化。本发明经密码子优化后得到的hIL‑2比天然序列在毕赤酵母中的表达量提高了132.1%，氨基酸序列优化后表达量又提高了96.5%。本发明同时提供了上述hIL‑2工业化高密度的发酵方法，本发明还提供了所述hIL‑2在白羽肉鸡和断奶仔猪养殖中的应用，将其添加到饲料中改善了白羽肉鸡的生长状况，降低了白羽肉鸡体内炎症因子，极大提高了白羽鸡的免疫力；添加到断奶仔猪日粮中提高了断奶仔猪的采食量和日均增重，降低了其腹泻率。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一类优化的人类白细胞介素-2基因及其表达方法和应用。

背景技术

白细胞介素(Interleukin，IL)是一类细胞因子。至2013年12月为止，至少发现并认可的白细胞介素有38种，依次命名为IL-1～IL-38。其中白细胞介素-2(IL-2)又称T细胞生长因子(TCGF)，主要由T细胞(特别是CD4+T细胞)产生，能够对多种细胞如T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和少突胶质细胞等产生作用，IL-2最显著的作用是影响T淋巴细胞的生长。IL-2能有效地提高机体免疫功能，是机体免疫调节网络中的核心物质，在抗病毒、抗细菌感染和抑制肿瘤细胞等有很好的效果，因此在临床中被广泛应用。

人类的白细胞介素-2(hIL-2)由133个氨基酸残基组成，分子量约15kD，等电点在6.6～8.2。IL-2具有一定的种属特异性，据报道，人类细胞只对灵长类来源的IL-2起反应，而几乎所有种属动物的细胞对人的IL-2敏感。

1983年科学家首次在猴细胞系中表达出IL-2，之后，不少学者在大肠杆菌中成功表达重组人白细胞介素-2，采用基因工程技术获得的hIL-2具有与天然相似的生物活性，可以大规模生产，以满足市场需要。但目前多数hIL-2的异源表达以大肠杆菌为宿主，其表达形式为包涵体，需要对细胞进行超声破碎，还需要后续的变性复性等复杂的工序，这种做法很难将工艺放大。且变性复性过程中容易破坏IL-2结构中的二硫键，正确的二硫键对IL-2的生物活性是必须的，因此用大肠杆菌表达的IL-2容易在后处理中失活。

发明内容

本发明的目的是提供了一类优化的人类白细胞介素-2基因及其表达方法和应用。本发明优化后得到的人类白细胞介素hIL-2产量高，活性稳定，应用效果好，在医药，饲料等行业有很好的应用前景，本发明为基因工程方法规模化生产hIL-2奠定了理论与实践基础。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了优化的人类白细胞介素-2hIL-2c的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO：3所示。

本发明提供了优化的人类白细胞介素-2hIL-2a，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明提供了权利要求2所述的hIL-2a的编码基因，其核苷酸如SEQ ID NO：5所示。

本发明提供了包含所述hIL-2c的编码基因或包含所述hIL-2a的编码基因的重组表达载体。

本发明提供了包含所述hIL-2c的编码基因或包含所述hIL-2a的编码基因的基因工程菌。

进一步的：所述基因工程菌为毕赤酵母GS115和毕赤酵母X33。

本发明提供了所述的基因工程菌的表达方法，包括以下步骤：

(1)hIL-2表达载体的构建：将优化后的hIL-2的编码基因构建到pPIC9K载体上，得到hIL-2表达载体；

(2)hIL-2基因的转化：将所述hIL-2表达载体酶切线性化电击转化入毕赤酵母感受态细胞中，利用组氨酸缺陷作为筛选标记筛选阳性克隆；