[发明专利]一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法

说明书

本发明公开了一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)将高亲和聚乙二醇抗体进行包被、封闭；(2)特异性单氨基酸偶联聚乙二醇作为标准品，取步骤(1)所得结果向其中加入稀释好的标准品、生物素标记的聚乙二醇结合物，另取步骤(1)所得结果加入样品、生物素标记的聚乙二醇结合物；(3)向步骤(2)中的标准品、样品中分别加入亲和素；(4)显色反应并读取OD值，计算样品含量。解决现有检测方法无法解决的交叉反应和机体通过各种途径摄入体内的外源性聚乙二醇的干扰，可定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物。

技术领域

本发明涉及生物医药检测领域，具体涉及一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法。

背景技术

聚乙二醇是一种常用的修饰剂，其毒性小，具有良好的亲和性，且生物相容性已获得FDA认可。蛋白类药物包括多肽、细胞因子、蛋白、抗体、酶等一些具有特殊功能的蛋白质。聚乙二醇化蛋白药物是聚乙二醇与蛋白类药物的化学修饰，化学修饰是延长蛋白质类药物半衰期的有效途径之一，聚乙二醇修饰可减少免疫原性，改善可溶性和生物利用度，增加抗蛋白水解作用。经聚乙二醇共价修饰后，蛋白类药物的相对分子量增加，延缓了药物排泄，从而明显改善蛋白质类药物的药动学和药效学性质。

聚乙二醇化蛋白药物的代谢、组织分布和排泄研究极具挑战，幸运的是前人对于聚乙二醇分子的体内代谢机制和安全性已经确立，如聚乙二醇化干扰素的代谢研究，就明确表明不论支链还是直链的聚乙二醇与药物形成的长效干扰素，聚乙二醇均可通过粪或尿排泄，而不在体内积蓄。聚乙二醇在体内主要通过乙醇脱氢酶将聚乙二醇的乙醇基氧化成羧酸代谢，因聚乙二醇化蛋白分子中聚乙二醇分子的主要代谢点“-OH”已被占用(一个被甲基化，另一个用于蛋白氨基偶联)，故极少通过酶代谢，因此聚乙二醇化蛋白药物的代谢主要与蛋白药物酶代谢有关,聚乙二醇不会发生酶代谢。

综合各种人或动物试验，相对分子质量190000以内的聚乙二醇分子，主要以原型形式从肾脏排除，较少部分经胆汁从肠道清除，因此研究肾脏或胆汁中排除的聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的含量便可分开判定代谢的聚乙二醇药物的量，为聚乙二醇化蛋白药物在体内的代谢提供辅助直观的数据。

通常，采用同位素标记以及同位素标记结合高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳，酸沉淀等方法研究生物技术新药的体内组织分布和排泄。同位素标记法通常用的是同位素标记聚乙二醇分子末端羟基(-OH)结合，但聚乙二醇化蛋白药物中聚乙二醇分子游离的一段是单甲基即mPEG(CH₃(-O-CH₂-CH₂)_n-)，另一端为活化基团与蛋白的氨基偶联,故PEG化蛋白药物分子中的聚乙二醇通常没有同位素标记的适合位点。此外采用质谱等方法通过直接检测聚乙二醇代谢产物的方法研究，聚乙二醇化蛋白的体内组织分布与排泄更是受到交叉反应和机体(人或动物)通过各种途径摄入体内的外源性聚乙二醇的严重干扰。因此目前研究聚乙二醇化蛋白药物体内组织分布和排泄试验方法存在明显的缺陷和限制。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，解决现有检测方法无法克服的交叉反应和机体摄入的外源性聚乙二醇的干扰，可定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物。

为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，包括如下步骤：

(1)将高亲和聚乙二醇抗体进行包被、封闭；

(2)特异性单氨基酸偶联聚乙二醇作为标准品，取步骤(1)所得结果向其中加入稀释好的标准品、生物素标记的聚乙二醇结合物，另取步骤(1)所得结果加入样品、生物素标记的聚乙二醇结合物；

(3)向步骤(2)中的标准品、样品中分别加入亲和素；

(4)显色反应并读取OD值，计算样品含量。