[发明专利]一种在植物细胞中生产中链脂肪酸的方法

权利要求书

1.一种在植物细胞中生产中链脂肪酸的方法，其特征在于，采用Cre/LoxP系统成功构建FatB3-LPAAT、FatB3-KASI或FatB3-LPAAT-KASI三种多基因系统并转入拟南芥中进行种子特异性共表达，包括下述步骤：

多基因共表达载体构建、农杆菌感受态的制备、多基因共表达载体转化农杆菌感受态、农杆菌蘸花法浸染拟南芥、转基因拟南芥验证、拟南芥种子荧光定量PCR及拟南芥种子脂肪酸提取并进行GC测定；

其中，FatB3基因信息的来源为GenBankAccession:JF338905.1、KASI基因信息的来源为GenBankAccession:JX275887、LPAAT基因信息的来源为GenBankAccession:XP_002522947.1；

多基因共表达载体构建包括下述步骤：

1）供体载体的构建：

（1）分别以Napin、FatB3和pYL322-d1或以Napin、FatB3和pYL322-d2质粒构建Napin-FatB3-d1/d2质粒，并以Napin-FatB3-d1/d2质粒与pYLTAC380DTH质粒混合电击转入能够产生Cre重组酶的大肠杆菌感受态 NS3529中，待NS3529活化后，将其涂在加入Kana⁺和Cm⁺的LB固体培养基中进行扩培，于37℃培养22 h；

（2）提取扩培后NS3529中的质粒，并对质粒进行I-SceI酶切，将酶切后的片段回收后，热激转入大肠杆菌感受态TransT1中，待TransT1活化后，将其涂在加有Kana⁺的X-gal培养基上，于37℃培养12 h，挑选白色菌落进行菌落 PCR，筛选出阳性菌落；

（3）对筛选出的阳性菌落进行扩培，然后提取扩培后TransT1菌液中的质粒，得到FatB3-380DTH质粒；

2）以FatB3、LPAAT及pYLTAC380DTH质粒构建多基因共表达载体；

（1）以启动子5400、LPAAT及pYL322-d1或以启动子5400、LPAAT和pYL322-d2质粒构建5400-LPAAT-d1/d2质粒，并以5400-LPAAT-d1/d2和FatB3-380DTH质粒按照1：1-2：1的比例电击转化大肠杆菌感受态NS3529中，待NS3529活化后，将其涂在涂有Kana⁺和Amp⁺的LB固体培养基中进行扩培，于37℃培养22 h；

（2）提取扩培后NS3529中的质粒，并对质粒进行 I-SceI酶切，将酶切后的片段回收后，热激转入大肠杆菌感受态TransT1中，待TransT1活化后，将其涂在加有Kana⁺的X-gal培养基上，于37℃培养12 h，挑选白色菌落进行菌落 PCR，筛选出阳性菌落；

（3）对筛选出的阳性菌落进行扩培，然后提取扩培后TransT1菌液中的质粒，得到FatB3-LPAAT-380DTH多基因共表达载体；

3）以FatB3、KASI及pYLTAC380DTH质粒构建多基因共表达载体：具体为按照FatB3-LPAAT-380DTH多基因共表达载体的构建方法将启动子16460、KASI和pYL322-d1或将16460、KASI和pYL322-d2构建16460-KASI-d1/d2质粒，并以16460-KASI-d1/d2质粒和 FatB3-380DTH重组构建FatB3-KASI-380DTH多基因表达载体；

4）以FatB3、LPAAT、KASI及pYLTAC380DTH质粒构建多基因共表达载体：将16460-KASI-d1/d2 和 FatB3-LPAAT-380DTH 重组构建多基因表达载体；

农杆菌蘸花法浸染拟南芥包括下述步骤：

1）以FatB3-LPAAT、FatB3-KASI或FatB3-LPAAT-KASI三种多基因系统转入农杆菌中，以转化后的农杆菌菌液在含有50 ug/mL Rif⁺和50 ug/mL Kana⁺抗生素的平板上划线，倒置于28℃培养2-3天；

2）挑起单菌落进行菌落PCR，选取阳性菌落接种于涂有Rif⁺和Kana⁺的20 mL液体培养基中，28℃、200 rpm震荡培养至OD₆₀₀=1.0；

3）按照比例配制农杆菌浸染液，500 mL浸染液中加入蔗糖25 g，Silwet77 50 μL,MES酸0.25 g，MS粉1.05 g，使用无菌水补充至500 ml；

4）选择野生型拟南芥花序最多的时期，将长成的果夹剪去，将花序浸没在浸染液中3min；

5）浸染完成后将拟南芥平放于盆内，置于黑暗中培养24 h，并于一周后重复浸染；浸染完成后将拟南芥正常放置，培养至结种。