[发明专利]一种在植物细胞中生产中链脂肪酸的方法

说明书

本发明公开了一种在植物细胞中生产中链脂肪酸的方法，采用Cre/LoxP系统成功构建FatB3‑LPAAT、FatB3‑KASI及FatB3‑LPAAT‑KASI三种多基因系统并转入拟南芥中进行种子特异性共表达，包括：多基因共表达载体构建、农杆菌感受态的制备、多基因共表达载体转化农杆菌感受态、农杆菌蘸花法浸染拟南芥、转基因拟南芥验证、拟南芥种子荧光定量PCR及拟南芥种子脂肪酸提取并进行GC测定的过程。本发明采用Cre/LoxP系统成功构建FatB3‑LPAAT、FatB3‑KASI及FatB3‑LPAAT‑KASI三种多基因系统，并转入拟南芥中进行种子特异性共表达，分析了三个基因组合共表达趋势，有效提高了植物细胞中合成中链脂肪酸的含量。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说是涉及一种在植物细胞中生产中链脂肪酸的方法。

背景技术

中链脂肪酸通常是指碳元素为6的脂肪已酸到碳元素为12的月桂酸。中链脂肪酸在人体中主要在胰腺被脂肪酶分解再通过血管运输到肝进行β氧化释放能量，其代谢速度是长链脂肪酸的10倍，不易形成肥胖。同时，中链脂肪酸在细胞内通过调节细胞代谢影响细胞信号强度，此外，中链脂肪酸与普通的动植物油相比较，它还具有较高氧化稳定性、粘度小、表面张力小和对各种化合物具有极好的溶解能力等优点，可以作为维生素、抗生素等各种医药品的良好溶剂。

天然的中链脂肪酸一般来自动物奶制品，其余主要来自油棕及椰子的提取，来源比较受限，而且油棕和椰子中的中链脂肪酸提取较复杂，且提取量少；而植物基因工程可定向改善植物的含油量从而提高单位面积的产油量，可采用共同可利用土地有限无法通过扩大种植面积来提高中链脂肪酸的总产量。目前利用基因工程的手段来生产中链脂肪酸的方法还未见报道。

因此，如何提供一种利用基因工程手段生产中链脂肪酸并提高中链脂肪酸总产量的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种在植物细胞中生产中链脂肪酸的方法，利用基因工程的手段，构建FATB3、LPAAT和KASI多基因共表达载体，并将其转入拟南芥中，在拟南芥中生产中链脂肪酸，增加了中链脂肪酸的产量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种在植物细胞中生产中链脂肪酸的方法，采用Cre/LoxP系统成功构建FatB3-LPAAT、FatB3-KASI或FatB3-LPAAT-KASI三种多基因系统并转入拟南芥中进行种子特异性共表达，包括下述步骤：

多基因共表达载体构建、农杆菌感受态的制备、多基因共表达载体转化农杆菌感受态、农杆菌蘸花法浸染拟南芥、转基因拟南芥验证、拟南芥种子荧光定量PCR及拟南芥种子脂肪酸提取并进行GC测定。

可选的，多基因共表达载体构建包括下述步骤：

1)供体载体的构建；2)以FatB3、LPAAT及pYLTAC380DTH质粒构建多基因共表达载体；3)以FatB3、KASI及pYLTAC380DTH质粒构建多基因共表达载体；4)以FatB3、LPAAT、KASI及pYLTAC380DTH质粒构建多基因共表达载体。其中，FatB3基因的序列如SEQ ID No.1所示；LPAAT基因序列如SEQ ID NO.2所示；KASI基因序列如SEQ ID NO.3所示。

可选的，供体载体的构建包括：

1)分别以Napin、FatB3和pYL322-d1或以Napin、FatB3和pYL322-d2质粒构建Napin-FatB3-d1/d2质粒，并以Napin-FatB3-d1/d2质粒与pYLTAC380DTH质粒混合电击转入能够产生Cre重组酶的大肠杆菌感受态NS3529中，待NS3529活化后，将其涂在加入Kana+和Cm+的LB固体培养基中进行扩培，于37℃培养22h；