[发明专利]多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种多功能特异性DNA杂化‑门控介孔二氧化硅基因载体及其制备方法和应用。以介孔二氧化硅颗粒为载体，出粒径在50‑100纳米的颗粒；在表面修饰锚定DNA并于DNA杂化体形成门控结构，实现了纳米颗粒的可以实现药物特定靶点释放。同时在颗粒表面修饰聚醚酰亚胺负载质粒，实现药物与基因联合治疗。本发明合成过程简便，无毒，快捷，产量大。在体外细胞毒性试验中，细胞存活率为75.1％～95％，这种多功能特异性DNA杂化‑门控介孔二氧化硅基因载体具有良好的生物安全性。

技术领域

本发明涉及一种多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体及其制备方法和应用。

背景技术

具有特异性识别和零过早释放的理想药物递送系统的设计，特别是由独特的内源性刺激引发的受控和特异性释放，在纳米载体的设计中一直是一个巨大的挑战。介孔二氧化硅纳米粒子(MSNPs)由于其可控的介孔结构，高比表面积，良好的生物相容性被广泛应用于药物递送系统。同时其表面具有的丰富可修饰集团，可用于开发其零过早释放，时空控释的功能。然而常规的载药介孔二氧化硅纳米颗粒在体外储存和体内运输的过程中都存在药物释放的问题，造成了药物的大量损失，同时可能产生一定的副作用。

微小RNA(miRNA)是短的非编码RNA分子，在各种细胞过程中调节基因表达。特别是在癌症发生，发展和转移期间，肿瘤与其正常组织对应物相比显示出不同的miRNA表达，因此为癌症诊断和分类以及潜在的治疗靶标提供了新的生物标志物。通过一般分子设计，抗miRNA 链可与DNA适体偶联形成DNA杂交体，对靶肿瘤细胞表面过表达的受体具有特异性识别能力，并通过互补碱基配对的方式对miRNA链具有排斥反应。由于适配体的二级结构，可能是双链体，四链体或发夹茎，设计的DNA杂合体不仅是一种有前途的双重识别生物分子和细胞的靶标剂，而且是受控药物的理想守门人。一旦通过DNA-杂化-门控纳米载体递送到肿瘤细胞中识别和内吞作用，过表达的内源性miRNA作为通过与DNA杂交体的竞争性杂交解锁纳米载体，并可以通过microRNA控制药物释放，从而导致肿瘤细胞的持续致死性。如果筛选出在特定病理细胞中专门表达的microRNA，化学疗法和基因疗法的组合应该为有针对性和个性化治疗人类疾病铺平道路。

同时，单一的药物治疗通常无法达到预想的治疗效果，基因转染作为一种非常常规的生物和医药技术，常与化学药物治疗进行联合治疗，从而实现更好的治疗效果。

由此我们设计了一种多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。其同时具有药物及基因荷载的功能，细胞毒性相对较小，并且可以实现药物特定靶点释放等优势。该新型多功能基因纳米载体具有重大的意义，在生物技术和医药技术领域具有重要的科研和临床应用前景。

发明内容

本发明为解决背景技术中提出的技术问题，提出一种多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体的制备方法及应用。

本发明的第一个技术方案是多功能DNA杂化-门控靶向介孔二氧化硅基因载体的制备方法，主要步骤包括：

1)介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：介孔二氧化硅纳米颗粒采用CTAB模板法制备，制得的直径为50～100纳米；

2)采用两步法制备水溶性羧基的介孔二氧化硅纳米颗粒；

3)在羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒表面修饰DNA杂化交联体，制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体。

4)DNA杂化-门控多功能介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺，制备多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。

所述的步骤1)介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法步骤如下：

1)介孔二氧化硅纳米颗粒采用CTAB模板法制得：1)在反应容器中配制浓度为1％～ 2％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液10～20毫升；