[发明专利]一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法

权利要求书

1.一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将重量比为10：1的胆固醇和卵磷脂溶解于溶剂，再除去溶剂得脂质体薄膜，加入与脂质体薄膜等重量的人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体；

将重量比为1：2的人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体和复方电解质注射液混合均匀得到人脐带间充质干细胞分泌因子注射液。

2.根据权利要求1所述的一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，其特征在于，所述溶剂为氯仿。

3.根据权利要求1所述的一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；

所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块；

所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P₁代人脐带间充质干细胞悬液；

所述干细胞的传代培养步骤包括待P_n代人脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P_n代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得P_n代人脐带间充质干细胞悬液，将P_n代人脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养，得P_n+1代人脐带间充质干细胞；

所述人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P_e代人脐带间充质干细胞达80-90%时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为5%的CO₂培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得人脐带间充质干细胞分泌因子；其中，e=3、4、5、6、7、8、9、10。

4.根据权利要求3所述的一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待P_m代人脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P_m代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将P_m代人脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。