[发明专利]一种外膜蛋白酶T酶解组蛋白并进行质谱分析的方法

权利要求书

1.一种外膜蛋白酶T酶解组蛋白并进行质谱分析的方法，其特征在于，利用底物特异性识别的外膜蛋白酶T直接与组蛋白进行一步酶切，产生适合于质谱分析长度的肽段，经过除盐以后进入液相色谱-质谱分析，对发生修饰的肽段进行定性和定量分析；具体步骤为：

（1）核心组蛋白提取：基于组蛋白的碱性特性，提取细胞核后用盐酸裂解提取核心组蛋白；

（2）蛋白纯化：将步骤（1）酸提后的组蛋白样品进行超滤置换溶液，用水置换后换成酶解缓冲液，去除盐酸和其他杂质；使组蛋白处于酶解液环境；酶解缓冲液为50mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH=6-7；

（3）蛋白酶解：向经步骤（2）处理后的蛋白中加入外膜蛋白酶T，外膜蛋白酶T和组蛋白的质量比1:(20-50)，充分混合，25-37摄氏度酶切12-16小时，使蛋白质完全酶解成氨基酸长度在6-20之间的肽段；

（4）质谱分析：对上一步得到的酶解产物酸化中止并高速离心，通过除盐柱富集上清中的肽段，冻干，具体为：用10%TFA 中止酶解反应，使得TFA的最终浓度为0.1%-0.5%；取上清后0.1%TFA溶液平衡除盐柱2-3次，上样3-5次，然后依次用0.1%TFA洗杂一次，80%ACN/0.1%TFA洗脱一到两次；

然后进行质谱检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述提取核心组蛋白的操作过程为：对蛋白样品，首先用缓冲液提取细胞核；采用盐酸裂解液提取细胞核：在细胞核沉淀中加入终浓度为0.1M-0.4M的盐酸，在4-10摄氏度下过夜慢摇孵育，使细胞中的核心组蛋白充分溶解在盐酸溶液里。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述蛋白纯化的操作过程为：将过夜提取后的粗蛋白10000g-12000g高速离心后，将上清转入3KDa的超滤管，用双蒸水洗涤2-3次，去除盐酸及其他杂质，最后用酶解缓冲液置换。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述蛋白酶解的操作流程为：先用BCA对核组蛋白进行蛋白定量，补充酶解缓冲液至蛋白浓度为0.5μg/μL -2 μg/μL ；然后加入外膜蛋白酶T，进行酶解。