[发明专利]一种外膜蛋白酶T酶解组蛋白并进行质谱分析的方法

说明书

本发明属蛋白质分析技术领域，具体为一种外膜蛋白酶T酶解组蛋白并进行质谱分析的方法。本发明方法包括：从细胞或组织样本中采用酸提法抽提核心组蛋白，超滤纯化组蛋白后与外膜蛋白酶T进行特定条件下的孵育酶解，最后将酶解完成的肽段经过除盐处理，送入液相色谱‑质谱鉴定和定量翻译后修饰。本发明方法操作方便，步骤简单，避免了传统组蛋白分析中的衍生化步骤，可实现对组蛋白翻译后修饰的精确鉴定和定量。

技术领域

本发明属于蛋白质分析技术领域，具体涉及一种利用外膜蛋白酶T酶解组蛋白并进行质谱分析的方法。

背景技术

现有技术公开了组蛋白上存在大量的翻译后修饰，例如甲基化，乙酰化。这些翻译后修饰在多种DNA依赖的生物过程中发挥重要功能，主要通过改变染色质高级结构或者招募特异结合的蛋白的方式参与转录激活，转录抑制，染色质的解聚等众多生物学过程。据研究报道，已发现组蛋白上存在20多种翻译后修饰，位于130个不同的位点和变体上，利用质谱技术高效快速灵敏的鉴定和定量这些后修饰是实现其进一步研究的首要前提。然而，基于质谱技术的组蛋白翻译后修饰研究面临着一些困难。首先，组蛋白的氨基酸序列中存在大量精氨酸和赖氨酸，例如核心组蛋白H3的序列中百分之二十三属于碱性氨基酸，因此传统胰蛋白酶消化产生的肽段片段非常小，亲水性很强，在反向色谱柱无法保留以至于质谱检测不到；第二，组蛋白赖氨酸和精氨酸上丰富的翻译后修饰会大大降低甚至完全阻碍胰酶的酶切效率；第三，尽管目前已有基于醋酸酐、丙酸酐等化学试剂可在组蛋白酶切前衍生化保护，但是这种方法存在以下缺点：丙酰化修饰也是一种内源的修饰，衍生修饰无法和天然的丙酰化修饰进行区分；其次，组蛋白丙酰化衍生时会发生一些侧链的副反应，包括甲基酯化，酰胺化，过度丙酰化和丙酰化反应不完全；最后，组蛋白进行的这两步衍生化操作繁琐，耗时耗力，对于一些生物分子实验室的可操作性差。因此，本申请的发明人拟提供一种底物序列特异识别的蛋白酶（外膜蛋白酶T）酶切组蛋白以产生适合质谱鉴定长度肽段的新方法，该方法将有利于快速实现组蛋白酶切肽段及翻译后修饰的质谱鉴定，从而进一步促进表观遗传领域中组蛋白翻译后修饰的研究。

发明内容

本发明的目的在于补充现有组蛋白质谱分析技术存在的缺陷，提供一种操作方便、无需化学衍生化、快速高效，实现组蛋白翻译后修饰的质谱鉴定新方法。

本发明提供了一种组蛋白一步酶解并质谱分析的新方法，尤其是利用外膜蛋白酶T来酶切组蛋白以产生适合质谱分析的肽段。本发明利用外膜蛋白酶T的特异底物识别序列（仅识别两个连续的碱性氨基酸，即-KK-，-RR-,-KR-，-RK-），这种酶切识别序列可产生适合质谱分析的肽段长度，并且对发生修饰的赖氨酸和精氨酸也具有较好的酶切效率，可以实现组蛋白一步酶切并进行翻译后修饰的质谱分析。

本发明提供的外膜蛋白酶T酶解组蛋白并进行质谱分析的方法，利用底物特异性识别的外膜蛋白酶T直接与组蛋白进行一步酶切，产生适合于质谱分析长度的肽段，经过除盐以后进入液相色谱-质谱分析，对发生修饰的肽段进行定性和定量分析；具体步骤为：

（1）核心组蛋白提取：基于组蛋白的碱性特性，提取细胞核后用盐酸裂解提取核心组蛋白；

（2）蛋白纯化：经步骤（1）酸提后的组蛋白样品进行超滤置换溶液，用水置换后换成酶解缓冲液，去除盐酸和其他杂质；使组蛋白处于酶解液环境；

（3）蛋白酶解：向经步骤（2）处理后的蛋白中加入外膜蛋白酶T，外膜蛋白酶T和组蛋白的质量比1:( 20-50)，充分混合，25-37摄氏度酶切12-16小时，使蛋白质完全酶解成氨基酸长度在6-20之间的肽段；

（4）质谱分析：对上一步得到的酶解产物进行高速离心，通过除盐柱富集上清中的肽段，冻干，然后进行质谱检测。

步骤（1）中，所述提取核心组蛋白的操作如下：对蛋白样品，首先用缓冲液提取细胞核；采用盐酸裂解液提取细胞核：在细胞核沉淀中加入终浓度为0.1M-0.4M的盐酸，在4-10摄氏度下过夜慢摇孵育，使细胞中的核心组蛋白充分溶解在盐酸溶液里。