[发明专利]一种组织完整、利于显微观察的植物组织切片的制备方法

权利要求书

1.一种鸭茅根部组织石蜡切片的制备方法，其特征在于，按如下步骤：

（1）杀死与固定

剪取新鲜鸭茅侧根部，用一次性双面刀片切取鸭茅根部组织块，约2~3 mm，后立即轻轻置于FAA混合固定液中固定、所述FAA混合固定液为体积比为1:1:18的福尔马林、冰醋酸、体积浓度70 %乙醇；固定液体积应为鸭茅根部组织块总体积的10~15倍；

（2）酸化

将固定好的鸭茅根部组织块置于0.5 mol/L三氯乙酸溶液中，酸化6-7 d，在酸化过程中，3-4 d时，更换一次0.5 mol/L三氯乙酸溶液；

（3）冲洗

剪取干净双层纱布折成方形，采用细小镊子将经酸化的鸭茅根部组织块置于纱布中央，用2 B铅笔做好材料名称及编号标记后，将纱布合拢，用尼龙绳将纱布绑好，以材料在流动的水中不漏出为准；将纱布小团置于流动的水中，冲洗24 h；

（4）琼脂糖预包埋

配制质量百分浓度为5 %的琼脂糖凝胶，经多次熬化后，倒入预先放置的4孔打孔器的平板上，厚度约5~7 mm，以备材料放入后进行封口；待琼脂糖冷凝后，取出打孔器，从流动的水中取出纱布团并打开纱布团，将冲洗完成后的鸭茅根部组织块横切面向上，依次用细小镊子轻放至凝胶孔底部，并将琼脂糖修整成规则的长条形，切去左上角以示材料编号，然后在酒精灯上进行琼脂孔的封口；

（5）脱水与透明

用镊子轻轻夹取包埋着的鸭茅根部组织琼脂块依次置于体积比为1:5:4的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为2:5:3的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为3:5:2的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为5:4:1的正丁醇、体积浓度为100%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比15:4:1的正丁醇、体积浓度为100%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于分析纯正丁醇中2 h，再置于新的分析纯正丁醇中2 h；

（6）浸蜡与包埋

在烘干的烧杯中倒入二甲苯，再倒入等量的液态软蜡制得体积比为1：1的二甲苯、软蜡混合剂，置于42℃恒温箱中备用；用细镊子夹取透明完全的鸭茅根部组织琼脂糖块轻放于42℃恒温箱中的二甲苯、软蜡混合剂，分I、II两级，各1 h；然后将琼脂糖块转移至纯软蜡在53℃恒温箱中浸蜡6 h，分I、II两级，各3 h；再转移至纯硬蜡在63℃恒温箱中浸蜡3 h，分I、II两级，各1.5 h；上述Ⅰ、Ⅱ两级是指重复两次，每次换上新的没使用过的相应蜡液；

在备好的包埋纸盒中，倒入纯硬蜡II中的硬蜡，同时夹取浸蜡完成的琼脂糖块，摆正切面，待包埋纸盒中的硬蜡表面开始冷凝成固体，则立即将整个包埋纸盒置于冷水中，使其立刻凝固成蜡块；

上述软蜡为熔点46~48℃的石蜡，硬蜡为熔点56~58℃的石蜡；

（7）修块与切片

剪开包埋纸盒，将石蜡块取出，用修块刀将石蜡块修成棱台形状，上、下切面平行，避开组织块，防止损伤组织块，然后固定在坚硬的小木方块上；用切片机夹夹紧木块，使蜡块与刀口平行，然后进行切片，切片厚度5~7μm；

（8）展片与烤片

经上述修块、切片后的蜡块成一连续条带状的蜡带，选取完整的蜡带分切成小段，先在洗净的载玻片上涂抹上一层由体积比为1:1的鸡蛋清和甘油组成的蛋白甘油粘贴剂、有效防止展片过程蜡带脱落，再用细小镊子轻轻地将蜡带放置于盛有蒸馏水的大烧杯内进行展片、预先将大烧杯放置于49~50℃恒温水浴锅内，保持大烧杯内水温与恒温水浴锅水温一致，用覆有所述蛋白甘油的载玻片进行捞片，用小镊子摆正蜡带位置、其位于载玻片下1/3~2/3处，用吸水纸吸去多余的水分，并用2B铅笔做好标记；然后将覆有蜡带的载玻片置于切片架上，于37℃恒温箱中烘片24 h；

（9）脱蜡、复水与番红染色

将干燥后的切片用二甲苯脱蜡三次，每次25分钟；脱蜡完毕后，即进入复水与番红染色系列：依次进入无水乙醇Ⅰ级、无水乙醇Ⅱ级、无水乙醇Ⅲ级、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中,乙醇均为体积百分浓度，每步停留4-5分钟，然后蒸馏水洗5秒后进入1%水溶液番红染液、质量浓度，密封过夜；上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级是指重复三次，每次换上新的没使用过的无水乙醇；

（10）固绿染色、脱水与透明

将经脱蜡、复水与番红染色处理的切片在95%乙醇中漂去浮色5-10秒，然后进入质量浓度为0.5%的95%乙醇固绿染液，保持30秒，所述95%乙醇为体积百分浓度；然后进行脱水：经三级分析纯无水乙醇处理，即为进入无水乙醇Ⅰ级、无水乙醇Ⅱ级、无水乙醇Ⅲ级，每级30秒-1分钟；脱水后进入透明处理：经三级分析纯二甲苯处理，即为进入二甲苯Ⅰ级、二甲苯Ⅱ级、二甲苯Ⅲ级，每级20分钟；上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级是指重复三次，每次换上新的没使用过的无水乙醇或二甲苯；

（11）封片

将上述透明好的切片从二甲苯中取出，用纱布擦干净多余的二甲苯，然后用中性树胶封片，即在要观察的组织块附近滴上封片剂，沿着一边轻轻地盖上盖玻片、以防止产生气泡，最后自然风干后即在显微镜下观察。