[发明专利]一种菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法及其固定化方法

权利要求书

1.一种菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

提取：取清洗干净的新鲜菠萝蜜果壳，按重量体积比为100g：(200ml-500ml)，溶于4℃-8℃预冷的pH值为5-6.5、浓度为0.1mol/L-0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液中研磨，匀浆，于4℃-8℃浸提24h，得到提取液；

纯化：将步骤1得到的提取液进行低温离心，取上清液，过丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，所述丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱的填料为Sephacryl S-200HR，填料平均粒径为50μm，柱床直径为25mm，柱床高度为280mm，上样量为1.5ml，用pH值为5-6.5、浓度为0.1mol/L-0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液，测定并收集有酶活性的洗脱液，即得到所述菠萝蜜过氧化酶。

2.根据权利要求1所述的菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法，其特征在于，所述低温离心的温度为4℃，转速为4000r/min，时间为15min。

3.根据权利要求1所述的菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法，其特征在于，所述洗脱的流速为0.5ml/min-1.0ml/min。

4.根据权利要求1所述的菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法，其特征在于，所述酶活性的测定方法为：取50μl菠萝蜜过氧化酶的洗脱液与150μl底物溶液反应，底物溶液含8mM邻苯二胺和52μM过氧化氢，用酶标仪测量A_450nm吸光值，吸光值每分钟增加0.001定义为一个酶活单位U。

5.根据权利要求1所述的菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法，其特征在于，所述菠萝蜜过氧化酶于4℃下保存。

6.由权利要求1-5任一项所述的菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法得到的菠萝蜜过氧化酶的固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：

配制硅前驱体溶液：在室温下，将不同体积的正硅酸甲酯与1mmol/L的HCL溶液混合，磁力搅拌30min，得到含正硅酸甲酯浓度为0.5-1.5mol/L的硅前驱体溶液；

固定化：室温下，将0.2mg/mL-0.8mg/mL权利要求1-5任一项得到的菠萝蜜过氧化酶、3mg/mL-15mg/mL聚乙烯亚胺和上述硅前驱体溶液按体积比为(0.5-2):1:1混合均匀，反应3min-5min后,将得到的反应物离心，收集沉淀，清洗，干燥，即得到固定化的菠萝蜜过氧化酶。

7.根据权利要求6所述的菠萝蜜过氧化酶的固定化方法，其特征在于，所述离心的转速为2000r/min-3000r/min，时间为3min-5min。

8.根据权利要求6所述的菠萝蜜过氧化酶的固定化方法，其特征在于，所述清洗采用蒸馏水，清洗的次数为3次，每次1min。

9.根据权利要求6所述的菠萝蜜过氧化酶的固定化方法，其特征在于，所述干燥的温度为30℃-40℃，时间为2h-3h。