[发明专利]一种菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法及其固定化方法

说明书

本发明公开了一种菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法及其固定化方法，属于固定化酶技术领域。所述菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法，包括如下步骤：提取：取清洗干净的新鲜菠萝蜜果壳，置于醋酸‑醋酸钠缓冲液中研磨，匀浆，浸提，得到提取液；纯化：将提取液进行低温离心，取上清液，过丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，用醋酸‑醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液，测定并收集有酶活性的洗脱液，即得到所述菠萝蜜过氧化酶。本发明还公开了上述菠萝蜜过氧化酶的固定化方法。本发明从新鲜菠萝蜜果壳中提取过氧化酶并进行纯化，开拓了过氧化酶的新来源，且菠萝蜜果壳属于农业废弃物，来源广泛，成本低廉。

技术领域

本发明涉及一种菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法及其固定化方法，属于固定化酶技术领域。

背景技术

酶作为一种生物催化剂，具有催化高效性、高选择性、反应条件温和等特点，能够应用于多种行业。但是天然酶存在容易失活、稳定性差、回收率低等特点，限制了其应用。

酶的固定化是指通过物理或化学的方法将酶分子固定到载体表面。其中，物理固定方法主要有吸附法和包埋法。吸附法操作简单，条件温和，不会引起酶的变性失活，但酶与载体结合部不太牢固而易脱落。包埋法虽然可以固定大量的酶，但酶在底物反应过程中造成较大的传质阻力。传统化学固定法是目前应用最多的酶固定化技术，酶与载体结合牢固，制得的固定化酶稳定性好，但制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，最终可能导致酶被固定化后失活较为严重。

过氧化酶是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，它们能催化很多反应。过氧化酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于载体的过氧化酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物和烃类氧化产物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类、醛类、苯类毒性的双重作用。过氧化酶广泛应用于医学检测、食品和化工等行业。

目前，市场销售的过氧化酶主要从十字花科植物辣根中提取、纯化，来源单一，价格比较昂贵，例如Sigma公司生产的辣根过氧化酶每100mg售价为1345元人民币；生工生物工程(上海)股份有限公司生产的辣根过氧化酶每100mg售价为400元人民币。而且，固定化过氧化酶通常采用海藻酸钠包埋的方法，机械强度较差；或采用戊二醛交联的方法，戊二醛是蛋白变性剂，使得包埋过程中酶活损失较高。在采用海藻酸钠包埋或戊二醛交联法制备固定化过氧化酶的文献报道中，酶活回收率仅为60-70％。

鉴于此，有必要研究一种新来源的过氧化酶并提供一种新的固定化方法。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法。本发明一是从新鲜菠萝蜜果壳中提取过氧化酶并进行纯化，开拓了过氧化酶的新来源，且菠萝蜜果壳属于农业废弃物，来源广泛，成本低廉；二是得到的菠萝蜜过氧化酶每100mg售价可控制在200元以内，远低于Sigma公司和上海生工的售价，市场前景广阔，适合规模化推广应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种菠萝蜜过氧化酶的提取、纯化方法，包括如下步骤：

提取：取清洗干净的新鲜菠萝蜜果壳100g，置于200ml-500ml的4℃-8℃预冷的pH值为5-6.5、浓度为0.1mol/L-0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液中研磨，匀浆，于4℃-8℃浸提24h，得到提取液；

纯化：将步骤1得到的提取液进行低温离心，取上清液，过丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，用pH值为5-6.5、浓度为0.1mol/L-0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液，测定并收集有酶活性的洗脱液，即得到所述菠萝蜜过氧化酶。

本发明的原理说明：

第一点：目前，市场销售的过氧化酶主要从十字花科植物辣根中提取、纯化，来源单一，而本发明是从新鲜菠萝蜜果壳中提取过氧化酶并进行纯化，开拓了过氧化酶的新来源，且菠萝蜜果壳属于农业废弃物，来源广泛，成本低廉。