[发明专利]一种角膜羟脯氨酸检测方法

说明书

本发明提供一种角膜羟脯氨酸检测方法，包括如下步骤:步骤一、标准曲线的建立；步骤二、角膜的消解；步骤三、消解后角膜吸光度的测定；步骤四、角膜羟脯氨酸的确定。其中角膜消解的步骤为将经过干燥恒重处理的角膜先用酶消解，通过酶解将角膜大部分转变成氨基酸和多肽，再用稀释后的一定浓度的硫酸进行酸消解。本发明所采用的角膜消解方法可明显降低角膜中羟脯氨酸的损失，消解过程中角膜消解无碳化现象发生，无需过滤，可大幅度提升检测的准确性和可靠性。

技术领域

本发明涉及羟脯氨酸检测技术领域，具体涉及一种角膜羟脯氨酸检测方法。

背景技术

角膜病是最主要的致盲眼病之一。有关数据表明： “角膜盲人”占全部盲人总数的1/4，人数约为800万，在这些患者中，绝大多数是9岁以下的儿童以及40－69岁的青壮年人，而复明的唯一手段就是角膜移植手术。但是，由于眼角膜的捐献者太少，全国各大医院每年可以完成的角膜移植手术只有2000-3000例，绝大多数的失明者目前只能在黑暗中苦苦地等待，人工生物角膜对于那些处于黑暗之中的人们来说迫切需要的，人工生物角膜有着它特别大的优点，其生物相容性好，人体的神经，细胞可以长在里面，从而使其变成自己身体的一部分，而角膜中胶原蛋白含量是评价角膜生物相容性好坏的一项重要指标，角膜本身胶原蛋白含量极高，经过干燥恒重处理，使单位质量角膜中胶原蛋白含量更高，普通的酸消解和碱消解都不能使其完全水解，使测得的羟脯氨酸含量偏低。胶原蛋白含量一般采用间接法检测其羟脯氨酸含量来换算，所以建立一种快速，准确，经济的羟脯氨酸测定方法是非常重要的。

羟脯氨酸的间接测定方法，主要是经前处理将样品水解，前处理的好坏直接影响到最终的测定结果。样品水解的方法主要有酸解法，碱解法和酶解法，酶解法由于不能使样品水解完全，碱解法在完全水解样品的同时会对有羟基的氨基酸造成破坏。而使用比色法检测时，含羟基的氨基酸也是其中的关键部分。现在技术对于胶原蛋白致密的角膜来说，酸解过程中会导致其碳化变黑，酸解不彻底，造成实验数据不准确。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种角膜羟脯氨酸检测方法。该方法通过先酶解后酸解的方法来对角膜进行前处理，先用酶消解，通过酶解破坏角膜致密结构，在保护角膜中羟脯氨酸的前提下最大限度的将角膜中的胶原蛋白转化为氨基酸和多肽，再酸解，可以使消解更完全，并有效降低羟脯氨酸的损失，同时避免碳化和杂质的产生，提高检测的准确性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、建立标准曲线：取不同浓度的羟脯氨酸标准溶液测定吸光度，以羟脯氨酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线；

步骤二、消解角膜：将角膜置于酶解液中，于水浴条件下酶解，向含角膜的酶解液中加入酸解液对角膜进行酸解，得到消解后角膜；

步骤三、测定吸光度：将消解后角膜冷却稀释后进行吸光度测定，记录结果；

步骤四、确定羟脯氨酸含量：将步骤三所得结果与步骤一所述标准曲线对比，得到角膜中羟脯氨酸的含量。

上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中所述酶解液中角膜含量为15g/L～25g/L。

上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，所述酶解液中角膜含量为20g/L。

上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，步骤二中所述酶解液包括蛋白酶K、氯化钙、三羟甲基氨基甲烷和水，所述酶解液中蛋白酶K的含量为1g/L，所述蛋白酶K、氯化钙和三羟甲基氨基甲烷的质量比为1:1.11:6.057。

上述一种角膜羟脯氨酸检测方法，其特征在于，所述酶解液的配制为取氯化钙和三羟甲基氨基甲烷加水溶解，加入pH调节剂调节溶液pH至7.4~8.0，向调节pH后的溶液中加入蛋白酶K，所述pH调节剂为HCl溶液。