[发明专利]C4植物叶肉细胞、维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法

说明书

本发明属于生物技术领域，本发明提供了设计出了一种C₄植物的叶肉细胞与维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法，通过破壁机的不同档位的机械作用，分别得到叶肉细胞及维管束鞘细胞的类囊体膜，该工艺简单，容易操作。采用本工艺提取类囊体膜，提取时间短，且与酶解法相比，本发明的工艺简单，提取时间短，且处理量大，最后通过本发明可以分别得到叶肉细胞的类囊体膜及维管束鞘细胞的类囊体膜，从而获得需要的蛋白等。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种C₄植物的叶肉细胞与维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法。

背景技术

光合作用是地球上最大规模的能量和物质转换过程，是几乎一切生命生存和发展的物质基础。光合作用分成两个过程。第一个过程是在类囊体膜上，太阳光激发光合电子传递系统中的叶绿素吸收太阳光，把光能转化成化学能，生成能量分子ATP和NADPH，这个过程叫光反应。第二个过程叫暗反应，在酶的催化下，消耗ATP提供的能量和NADPH，将二氧化碳和水合成碳水化合物。

根据固碳方式的不同可以将植物分为碳三植物（C₃植物），如小麦、大豆、水稻、烟草、棉花等；碳四植物（C₄植物），例如玉米、甘蔗、高粱等。碳三植物固碳效率低，碳四植物中有一种特殊的花环结构，这种结构特征将光合作用反应分在两种不同类型的细胞内，叶肉细胞和维管束鞘细胞，维管束鞘细胞环绕维管组织，与此同时，一个外部的叶肉细胞环包绕维管束并与细胞间隙相邻。C₄植物把用于碳固定和碳还原的细胞分开的类囊体膜结构对于二氧化碳的吸收和高效的进行光合作用是十分必要的。

叶绿体是植物及某些高等藻类进行光合作用的主要场所。植物叶绿体内部由基质和类囊体组成，基质是光合作用暗反应的场所，类囊体是光合作用光反应的场所，是光捕获、光合电子传递、质子易位及 ATP 合成的位点，因此大部分与光合作用有关的蛋白质和蛋白复合物均定位于类囊体膜及类囊体腔中，类囊体膜系统主要包括四种高丰度的多亚基膜蛋白复合体，即 PSI、PSII、Cytb6f及ATP合酶。叶绿体类囊体膜中的蛋白质复合体是植物进行光能吸收、传递和转换的关键部位，因而一直是光合作用研究的热点。随着膜蛋白提取分离效率的提高，在此基础上研究类囊体蛋白质的结构及功能将有助于我们更深入地了解叶绿体类囊体的功能及其代谢规律。

现阶段叶肉细胞与维管束鞘细胞的分离提取工艺大多为酶解法，该工艺耗时长、且费用消耗大。采用酶解法一般是将叶片小条放入含有纤维素酶、果胶酶的缓冲液，使细胞壁酶解。酶解下来的细胞再通过滤、涨破、离心等操作得到类囊体膜。但是酶解法通常需要较长的时间的酶解反应才能得到原生质体，而且随着需要得到类囊体膜的量的增加，酶的使用量也会随之增大，费用也会增大。酶解法对于一些成熟的叶片酶解的时候效果也不是很好。

发明内容

针对现阶段类囊体膜分离存在的问题，本发明提供了设计出了一种C₄植物的叶肉细胞与维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法，该方法操作简单、成本低，且可大量快速纯化。

一种C₄植物叶肉细胞和维管束鞘细胞的类囊体膜的分离提取方法，包括以下步骤：

（1）取C₄植物的叶片，清洗后擦掉水分，去掉叶片中间的叶脉，将叶片剪成0.5-1cm小条；

（2）取剪碎的叶片放入在冰箱提前预冷的破壁机，加入预冷后的捣碎液，破碎至叶片外层的叶肉细胞80-90％掉落；

（3）低温过滤，捣碎液涮洗破壁机，再过滤，合并滤液，即为叶肉细胞；

（4）将步骤（3）的滤渣加入预冷后的捣碎液，继续破碎至叶肉细胞95%及以上掉落；过滤，留滤渣，弃滤液；

（5）将步骤（4）的滤渣加入预冷后的捣碎液，破碎至维管束鞘细胞90-99%及以上掉落，过滤，滤液即为维管束鞘细胞；