[发明专利]鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的引物组及检测试剂盒在审
| 申请号： | 201910181313.4 | 申请日： | 2019-03-11 |
| 公开（公告）号： | CN109735662A | 公开（公告）日： | 2019-05-10 |
| 发明（设计）人： | 朱俊辉;陈立思;何玉友;王国辉;廉维;杨泽彬;王石;李长艳;白杨;贾小营 | 申请（专利权）人： | 吉林正业生物制品股份有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6848;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京思元知识产权代理事务所(普通合伙) 11598 | 代理人： | 余光军;曾晖 |
| 地址： | 132101 吉林省*** | 国省代码： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 猪流行性腹泻病毒 变异毒株 鉴别 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪传染性胃肠炎病毒 流行病学调查 特异性扩增 特异性引物 伪狂犬病毒 检测结果 检测试剂 轮状病毒 敏感性比 特异性强 猪瘟病毒 引物组 扩增 筛选 敏感 治疗 保证 | ||
1.用于鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的Nano-nest PCR引物组，其特征在于，由Nest F1/R1引物对和NestF2/R2引物对组成；其中，所述Nest F1/R1引物对由SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的两条引物组成，所述Nest F2/R2引物对由SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示的两条引物组成。
2.权利要求1所述的Nano-nest PCR引物组在鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株中的应用。
3.一种鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的Nano-nest PCR检测试剂盒，包含以下各组分：权利要求1所述的Nano-nest PCR引物组，RNA反转录试剂以及Nano-nest PCR扩增试剂。
4.按照权利要求3所述的Nano-nest PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的RNA反转录试剂包括：2×TS Reaction MIX，RT/RI Enzyme MIX和Oligo(dT)Primer。
5.按照权利要求3所述的Nano-nest PCR检测试剂盒，其特征在于所述的Nano-nestPCR扩增试剂包括：Nanoparticles MIX和ddH2O。
6.权利要求3-5任何一项所述的Nano-nest PCR检测试剂盒在鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株中的应用。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：
(1)提取待检测样品的RNA；
(2)将检测样品的RNA用RNA反转录试剂反转录得到cDNA；
(3)将反转录得到cDNANano-nest PCR扩增试剂建立Nano-nest PCR扩增体系并进行第一轮巢式PCR扩增和第二轮巢式PCR扩增；
(4)所述的Nano-nest PCR具体结果判定过程是，当第一轮巢式PCR反应出现817bp大小片段判为PEDV阳性；第二轮巢式PCR反应出现295bp大小片段则判定为PEDV变异毒株；若无扩增条带判为PEDV经典毒株。
8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的第一轮巢式PCR扩增体系包括：16μLNanoparticles MIX，Nest-F1和Nest-R1各0.5μL，ddH2O 5μL，反转录得到cDNA 3μL，共计25μL；
所述的第二轮巢式PCR扩增体系包括：16μL Nanoparticles MIX，Nest-F2和Nest-R2各0.5μL，ddH2O 5μL，第一轮巢式PCR产物3μL，共计25μL。
9.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：
第一轮巢式PCR反应程序为：PCR预变性95℃5min，变性94℃30s，退火57℃30s，72℃延伸55s，共计35个循环，最后72℃再延伸10min；
第二轮PCR反应程序为：95℃3min，变性94℃30s，退火58℃30s，72℃延伸25s，共计30个循环，最后72℃再延伸10min。
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