[发明专利]鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的引物组及检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种可鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的Nano‑nest PCR检测试剂盒。本发明首先筛选获得2对特异性引物，其只扩增猪流行性腹泻病毒，对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均无非特异性扩增，能保证检测结果的准确性；在此基础上，本发明建立了一种可鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的Nano‑nest PCR检测方法，该方法准确性高、特异性强、成本低，敏感性比普通PCR敏感100倍，适用于猪流行性腹泻病毒流行病学调查，也能适用于PEDV精准治疗和防控。

技术领域

本发明涉及猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的鉴别，尤其涉及鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的引物组以及Nano-nest PCR检测试剂盒，属于猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的分子鉴别领域。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为冠状病毒科，α冠状病毒属成员，可引起仔猪发生急性型腹泻、呕吐及脱水等临床症状，最终导致病猪因电解质平衡紊乱而致死的消化道病毒，给世界养猪业造成重大经济损失。PEDV是一种有囊膜，形态呈皇冠状的单股正链RNA病毒，基因组全长28kb，编码3个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)和4个结构蛋白(S、E、M和N)，其中S蛋白是PEDV最重要的结构蛋白之一，因其与病毒感染吸附、受体融合、致病作用和诱导中和抗体产生等方面活动密切相关。自1971年PEDV被发现以来其一直以CV777经典毒株广泛流行于世界各国，直到2010年一种新型PEDV变异毒株再次重创中国养猪业，随后韩国、日本、泰国、美国、西班牙、加拿大和墨西哥等国也相继报道，致使数以亿计病猪死亡，造成不可估量的经济损失。

然而，由于可引起猪群腹泻病原较多且临床症状相似，很难从临床诊断得以区分病原类型。因此陆续有多种实验室检测方法被建立如ELISA、RT-PCR、RT-LAMP和TaqManqPCR等方法。但是当前检测方法不仅操作繁琐，时间长，敏感度低和仪器昂贵等诸多劣势，且面对当前以PEDV经典和变异毒株共同流行的复杂流行态势给PEDV精准诊断带来较大困扰；因此，亟待需要研制一种稳定性好、敏感性高的能够同时鉴别PEDV经典与变异毒株的的方法。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一组鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的引物组；

本发明所要解决的第二个技术问题是鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的Nano-nest PCR检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明根据猪流行性腹泻病毒经典毒株与变异毒株在S基因N端的15个碱基的插入及6个基因的缺失，以这段主要突变差异设计多对巢式PCR引物，最终从多对的巢式PCR引物中筛选获得2对特异性引物，其只扩增猪流行性腹泻病毒，对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均无非特异性扩增，能保证检测结果的准确性；在此基础上，建立nest PCR方法并将可提高PCR敏感性和准确性的Nano粒子加入PCR反应中，最终建立一种可鉴别诊断变异株与经典毒株的Nano-nest PCR检测方法以及相应的检测试剂盒。

本发明首先提供了一组可鉴别猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株的Nano-nestPCR检测引物组，由Nest F1/R1引物对和Nest F2/R2引物对组成；其中，所述Nest F1/R1引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条引物组成，所述Nest F2/R2引物对由SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的两条引物组成；其中Nest-F1和Nest-R1引物可同时扩增PEDV经典毒株和变异毒株，扩增片段长度为817bp。Nest-F2和Nest-R2引物只可扩增变异毒株，而不能扩增经典毒株，扩增片段长度为295bp。