[发明专利]一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统及其制备方法

权利要求书

1.一种双巯基修饰的三枝状DNA支架，其特征是由3种DNA单链组成，第1种DNA单链分为1-1段和1-2段，在1-2段的3’端连接有巯基；第2种DNA单链分为2-1段和2-2段，在2-2段的3’端连接有巯基；第3种DNA单链分为3-1段、3-2段和3-3段；第1种DNA单链的1-1段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-2段核苷酸序列反向互补配对；第1种DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2种DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；第2种DNA单链的2-2段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对。

2.根据权利要求1所述的一种双巯基修饰的三枝状DNA支架，其特征是第1种DNA单链的核苷酸数为38-78个；第2种DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-3段的DNA单链的核苷酸数为22-26。

3.一种双巯基修饰的三枝状DNA支架的制备方法，其特征是包括如下步骤：

(1)取摩尔数相同的第1种DNA单链、第2种DNA单链和第3种DNA单链溶于80-100mM的NaCl水溶液中，混匀，置于PCR仪中，控制温度由95-90℃，在0.8-2小时内降温到25-4℃；

第1种DNA单链分为1-1段和1-2段，在1-2段的3’端连接有巯基；第2种DNA单链分为2-1段和2-2段，在2-2段的3’端连接有巯基；第3种DNA单链分为3-1段、3-2段和3-3段，第1种DNA单链的1-1段核苷酸序列能与第3种DNA单链的3-2段核苷酸序列反向互补配对；

第1种DNA单链的1-2段核苷酸序列能与第2种DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；

第2种DNA单链的2-2段核苷酸序列能与第3种DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对；

(2)按第1种DNA单链和补骨脂素摩尔比为1：10-100的比例，向步骤(1)中加入补骨脂素，混合，在365nm的紫外下照射，照射能量为1-4J，获得双巯基修饰的三枝状DNA支架。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述第1种DNA单链的核苷酸数为38-78个；第2种DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-3段的DNA单链的核苷酸数为22-26。

5.双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因，其特征是双巯基修饰的三枝状DNA支架的第3种DNA单链的3-3段连接有含有目标蛋白基因的DNA序列。

6.权利要求5的双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因的制备方法，其特征是包括如下步骤：向EP管中加入双巯基修饰的三枝状DNA支架，使终浓度为0.15-1.6μM，加入线性引物，使终浓度为0.15-1.6μM，加入含有目标蛋白基因的质粒，使终浓度为0.1-3ng/μl和1╳DNA聚合酶，用去离子水补齐50μl体系，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因。

7.一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统，其特征是双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因中的双巯基与金纳米颗粒连接。

8.权利要求7的一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统的制备方法，其特征是包括如下步骤：向EP管中加入金纳米颗粒和双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因，混合，于-20℃放置2-12小时，在室温下，使体系融化，得到一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统；金纳米颗粒与双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因的摩尔比为1:2-30。

9.一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统在无细胞蛋白质生产的应用，其特征是包括如下步骤：按体积比为(10-20):(15-35):1的将细胞提取物，补充缓冲液，用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统混合，加入终浓度0.4-1.2mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，于恒温反应容器中，在30℃表达目标蛋白。