[发明专利]一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统及其制备方法，其中的基因载体系统是双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因中的双巯基与金纳米颗粒连接。本发明的基因载体系统，在分子水平上拉近表达基因之间的空间距离，并应用于无细胞蛋白生产，由于表达基因空间距离的拉近，可以大大提高蛋白表达产量和生产效率。

技术领域

本发明属于生物合成技术领域，特别是涉及一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统及其制备方法。

背景技术

蛋白质作为基因功能的执行体，在调节生命活动方面具有重要作用，依赖于近几十年对蛋白质结构和功能知识的不断积累，蛋白质药物逐渐发展成熟，对肿瘤、感染、自身免疫性疾病、代谢性遗传病、各种老年病及退行性疾病等几乎所有疾病领域均具有重要影响，正在成为21世纪重要的治疗、预防和诊断用药。如何高效率、高产量的生产蛋白质是蛋白质药物的发展和应用的关键性问题。

无细胞蛋白合成系统(cell-free protein synthesis，CFPS)作为一种体外生命模拟体系，以外源脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)为模板，利用细胞提取物中的蛋白合成酶系、蛋白折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、聚合酶和能量物质，在体外完成模拟细胞内蛋白合成与翻译后修饰过程。CFPS简便快速，避免了细胞系统蛋白合成过程中多步繁琐的基因克隆步骤，能够在极短时间内完成蛋白质的合成，这是传统的生物合成所不能实现的，而且相较于细胞系统，CFPS的可控性和可操作性更强，可在蛋白合成过程中，随时对系统进行人为干预，在生产蛋白药物方面具有潜在应用价值。

然而，提高CFPS系统合成效率是其应用于蛋白药物生产待解决的紧要问题。通过优化CFPS系统提高系统的蛋白表达量是扩大体外无细胞表达系统应用范围的关键程序。CFPS的优化可从体系微环境、细胞提取物、体系反应形式和基因等多个层次展开。基因作为目标蛋白的信息使者，其存在形式、结构和所处环境对于蛋白产量具有重要影响。通过构建不同基因载体结构，提高CFPS蛋白表达效率和产量已被初步证实是一条有效的优化CFPS系统的途径。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种双巯基修饰的三枝状DNA支架。

本发明的第二个目的是提供一种双巯基修饰的三枝状DNA支架的制备方法。

本发明的第三个目的是提供双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因。

本发明的第四个目的是提供双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因的制备方法。

本发明的第五个目的是提供一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统。

本发明的第六个目的是提供一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统的制备方法。

本发明的第七个目的是提供一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统在无细胞蛋白质生产的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种双巯基修饰的三枝状DNA支架，是由3种DNA单链组成；第1种DNA单链分为1-1段和1-2段，在1-2段的3’端连接有巯基；第2种DNA单链分为2-1段和2-2段，在2-2段的3’端连接有巯基；第3种DNA单链分为3-1段、3-2段和3-3段；第1种DNA单链的1-1段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-2段核苷酸序列反向互补配对；第1种DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2种DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；第2种DNA单链的2-2段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对。

优选地，第1种DNA单链的核苷酸数为38-78个；第2种DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-3段的DNA单链的核苷酸数为22-26。

一种双巯基修饰的三枝状DNA支架的制备方法，包括如下步骤：