[发明专利]一种LAG3基因人源化动物模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种制备LAG3人源化动物模型的方法，其特征在于，所述人源化动物中，动物Lag3基因的胞外区域被替换为人源LAG3的基因对应片段，保留动物LAG3的胞内信号转导区，具体包括以下步骤：

(1)构建表达针对鼠源Lag3基因的sgRNA的质粒；所选sgRNA所处位置更加有利于基因重组；

(2)构建人源化LAG3基因的打靶载体；

(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产LAG3基因修饰人源化鼠模型，其中所述人源化LAG3基因的打靶载体包含嵌合序列SEQ ID NO：10，其中1-808bp及5797-6599bp为鼠源序列，809-5796bp为人源序列；其中针对鼠源Lag3基因的sgRNA的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6所示。

2.如权利要求1所述的方法，进一步包括利用引物鉴定所述动物模型的基因型的步骤。

3.如权利要求2所述的方法，其中鉴定所述动物模型的基因型使用的引物为：

4.如权利要求3所述的方法，进一步包括对对两端PCR鉴定阳性的小鼠克隆进行测序验证。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述测序使用的引物如下：

引物名称	引物序列
YF000087-HuLAG3-5seqR1	CTGTCCTACAGTCTGCCTGC(SEQ No.17)
YF000087-HuLAG3-5seqF1	AGAATGAAGGTTAACACCGTG(SEQ No.18)
YF000087-HuLAG3-5seqF2	GTTCTAGCTAGCTGCAGTGG(SEQ No.19)
YF000087-HuLAG3-5seqF3	GCCATAGAGGAGATGTGGGAG(SEQ No.20)
YF000087-HuLAG3-5seqR2	GGACTGGAGACAGCAGGATG(SEQ No.21)
YF000087-HuLAG3-5seqR3	AGAGGCTTTCGGGGTGGAAG(SEQ No.22)
YF000087-HuLAG3-3seqR1	CACACAGCACTCTGAGGTCTG(SEQ No.23)
YF000087-HuLAG3-3seqF1	TCTAGTCCTGACCCTATGCCTC(SEQ No.24)
YF000087-HuLAG3-3seqF2	AGAGCCCAGGCAGCTCTGAC(SEQ No.25)

。

6.权利要求1-5任一项所述的方法制作的LAG3基因人源化动物模型在评估靶向LAG3的药物有效性、LAG3靶向药物筛选开发、LAG3靶向药物联合其他药物抗肿瘤药效评价、或LAG3靶向药物的毒理研究中的应用，所述应用为非疾病诊断非疾病治疗目的。