[发明专利]一种LAG3基因人源化动物模型的构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种制备LAG3人源化动物模型的方法及其应用，该方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将鼠Lag3基因编码胞外区的部分替换为相应的人源LAG3基因片段，同时保留了鼠Lag3基因的胞内信号转导区，保证了细胞信号的正确传导不受影响。该模型是筛选人LAG3抑制剂药物的理想动物模型。

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种LAG3基因修饰人源化动物模型的构建方法。

背景技术

复杂的生物过程通常需要进行体内分析，而人体内生物学的研究受到道德和技术的严重限制，因此越来越需要动物模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究。目前，科学家们已经开发了多种人源化小鼠或人鼠嵌合体来克服这些限制，并且现在已经成为人体细胞和组织体内研究的重要工具。

在临床药物的研发过程中，小鼠被广泛用于候选药物临床前的安全性及有效性评价，如新型抗病毒药物的体内有效性评价、肿瘤的免疫治疗和开发新型的化学治疗药物、新型抗自身免疫病药物的治疗效果、药物体内代谢和肝毒性、人源抗体的前期开发评估等。

然而，通过临床前评估的候选药，大部分会在临床I期失败，小鼠与人体内生理、病理等的差异是重要的因素：人鼠免疫系统的差异、许多致病因子和药物在人鼠之间的种系特异性、药物靶点与受体在人鼠之间的亲和力差异、人源肿瘤与鼠源肿瘤的差异等都将影响临床前与临床数据的一致性。因此，构建具有人的功能性基因、细胞及组织的人源化小鼠模型具有重要的意义，可以随着人源化小鼠的不断完善，更好的反应预期临床数据。

抗肿瘤免疫疗法在近两年掀起研究热潮，Checkpoint许多药物已获得了临床批准用药，并取得了可喜的成绩。LAG3(Lymphocyte activation protein 3)，淋巴细胞活化蛋白3，在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞和浆细胞样树突状细胞上表达。LAG3基因编码的膜蛋白包含四个免疫球蛋白超级家族结构域，在结构和染色体定位方面与CD4非常相似，但它以更高的亲和力与MHC II(主要组织相容性复合体II类分子)结合，并负调节T细胞的功能。

研究表明，敲除LAG3基因或体内抗体阻断LAG3功能，可使器官或肿瘤中的抗原特异的CD8+T细胞的聚集和效应功能增加。因此，阻断LAG3是一种潜在的肿瘤治疗方法。

申请人利用基因编辑技术将鼠Lag3基因编码胞外区的部分替换为相应的人源LAG3基因片段，同时保留了鼠Lag3基因的胞内信号转导区，保证了细胞信号的正确传导不受影响。该模型是筛选人LAG3抑制剂药物的理想动物模型。

在此过程中，我们构建了针对鼠Lag3基因的sgRNA和携带人LAG3基因片段的载体，我们对于CRISPR/Cas9技术中用到的各个原件包括sgRNA等进行了充分的优化和调整，保证了采用该技术制备人源化LAG3基因动物模型的高成功率和高准确率。

发明内容

本发明提供了一种制备LAG3人源化动物模型的方法，其特征在于，所述人源化动物中，动物LAG3基因的胞外区域被替换为人源LAG3的基因对应片段，保留动物LAG3的胞内信号转导区。

优选地，其包括以下步骤：

(1)构建表达针对鼠源Lag3基因的sgRNA的质粒；

(2)构建人源化LAG3基因的打靶载体；

(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产LAG3基因修饰人源化鼠模型。

优选地，其中所述人源化LAG3基因包含嵌合序列SEQ ID NO：10。

优选地，其中针对鼠源Lag3基因的sgRNA的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6所示。