[发明专利]一种体外人睾丸精子发生模型的制备方法

说明书

一种体外人睾丸精子发生模型的制备方法。将人睾丸组织分离为的小块，置于提前至少8小时进行完全睾丸培养基置换过的0.25%‑1.5%的琼脂块上，加入完全睾丸培养基到达琼脂块高度的1/3~2/3，于32℃‑37℃，5%二氧化碳环境中进行培养10‑100天。该模型为体外研究人类睾丸精子发生提供了平台，并为将支持旨在了解睾丸器官发生复杂性的研究，并为开发急需的男性不育治疗提供一个研究平台。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种在体外构建人睾丸完整生精上皮完成减数分裂获得精子细胞的方法。

背景技术

精子发生是指从精原细胞发育成为成熟精子的一个连续而复杂的生物学过程，包括了精原细胞的自我更新、精母细胞的减数分裂和精子细胞的变形三个阶段。睾丸精子发生容易存在遗传突变、内分泌紊乱的风险以及受到环境内分泌干扰物的影响。已有的数据显示，儿童肿瘤发病率为每1000名儿童中有1.0至2.5例，经过治疗后约三分之一的男性面临无精症的风险。体外人睾丸精子发生建立了研究生殖细胞和睾丸体细胞形成发育的遗传、表观遗传和环境因素，以及对研究各种精子发生障碍的病理机制提供研究模型，为青春期前男性肿瘤患者生育能力的建立提供技术储备。

在体外，完成减数分裂以产生单倍体配子是建立体外人睾丸精子发生模型的终极目标。为了避免对体外减数分裂的误解，生殖生物学家制定了一套“减数分裂金标准”，用于评价在体外衍生出反映减数分裂关键事件的配子。为了证明体外减数分裂的发生，需获得正确的细胞核DNA含量、正常的染色体数量、染色体同源重组和正常后代。虽然经过多次尝试，但人类仍未达到符合“金标准”的体外减数分裂。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种体外人睾丸精子发生模型的制备方法。该模型既支持精原干细胞（SSC）自我更新，精母细胞的减数分裂及单倍体精子细胞成熟的功能性生精管腔的形成，是生殖医学研究的重大突破。据我们所知，这是关于人类性腺生殖细胞减数分裂的第一次报告，形成了能够通过单精子卵细胞胞浆注射使体外成熟的卵细胞受精的功能性精子，并通过符合“减数分裂金标准”进行体外减数分裂，包括获得正确的细胞核DNA含量、正常的染色体数量等。

技术方案：一种体外人睾丸精子发生模型的制备方法，包括以下步骤：将人睾丸组织离体后分离为小块，置于提前至少8小时进行完全睾丸培养基置换过的0.25%-1.5%的琼脂块上，加入完全睾丸培养基到达琼脂块高度的三分之一到三分之二，于32-37℃，5%二氧化碳环境中进行培养10-100天。

优选的，上述人睾丸组织包括各种年龄阶段人睾丸。

优选的，上述琼脂块浓度为0.25%。

优选的，上述培养温度为34℃。

优选的，上述完全睾丸培养基的成分包含：90%（v/v） αMEM，10%（v/v）血清替代物（KOSR），10-50 ng/mL胶质细胞源性神经营养因子(GDNF) 、10-50 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)、10-50 ng/mL表皮生长因子(EGF)、50-100 ng/mL转化生长因子β家族激活素A（Activin A）、10-50 ng/mL干细胞生长因子（SCF）、10-50 ng/mL骨形态发生蛋白（BMP 4/7）、10-50 mM睾酮(testosterone)、100-200 ng/mL促卵泡激素（FSH）和50-100 mg/mL垂体提取物（BPE）。