[发明专利]基于PCR-金磁纳米免疫层析的肺炎支原体检测方法

说明书

本发明公开了基于PCR‑金磁纳米免疫层析的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的特异性引物；提取待测样本的DNA、以待测样本的DNA为模板，以特异性引物为引物进行PCR扩增得到待测样本MP靶片段扩增产物，获得的扩增产物使用肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条进行检测。本发明基于PCR‑金磁纳米免疫层析的肺炎支原体检测方法，操作简单，能够快速检测肺炎支原体。

技术领域

本发明属于分子生物检测技术领域，涉及一种基于PCR-金磁纳米免疫层析的肺炎支原体检测方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是一种常见的呼吸系统感染病原体，是社区获得性肺炎(Community acquired pneumonia,CAP)最主要的病原体之一。肺炎支原体感染临床表现不具有特征性，容易和其他病毒、细菌所致的呼吸道感染相混淆，且常与其它病原菌发生混合感染，因此临床需要一种灵敏、快速、特异的检测方法来早期确诊肺炎支原体肺炎，以便及时、正确用药，减少并预防耐药性。

目前肺炎支原体检测的方法主要有分离培养、血清学抗体检测和PCR诊断。但是肺炎支原体分离培养进行检测时需要耗费较长的时间，且培养条件苛刻，灵敏度不高，用于临床诊断意义不大；而目前进行血清科学抗体检测主要有两大类：一类是血清肺炎支原体抗体IgM或IgG检测，一类是肺炎支原体核酸(MP-DNA)检测。血清学检测简便快捷，在临床上得到了广泛的应用。但这种方法仅对既往感染能提供较好的检测指标，而对现症感染考核的应用价值较低，

荧光定量PCR是MP-DNA检测中最常用的方法，但该方法操作复杂，且存在荧光探针、仪器价格昂贵等问题，许多基层临床单位尚不能开展。所以研究并开发用于MP检测关键技术和相关检测产品具有重大临床意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于PCR-金磁纳米免疫层析的肺炎支原体检测方法，操作简单，能够快速检测肺炎支原体。

本发明所采用的技术方案是，基于PCR-金磁纳米免疫层析的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：

步骤1，针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的特异性引物；提取待测样本的DNA；

步骤2，以待测样本的DNA为模板，以特异性引物为引物进行PCR扩增得到待测样本DNA扩增产物；

步骤3，将待测样本DNA扩增产物使用肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条进行检测。

本发明的特点还在于：

特异性引物为：

MP-F：5’-Digoxin–AAGGACCTGCAAGGGTTGT-3’；

MP-R：5’-Biotin-CTCTAGCCATTACCTGCTAA-3’。

步骤2中PCR扩增程序为：

UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min。

进行PCR扩增时，按照体积分数，向PCR管加入10％的10×Taq buffer、8％的d NTP(A:U:C:G)、1％的HotMaster Taq DNA酶、1％的UNG酶、4％～10％的特异性引物、2％～10％的模板和60％～74％的dd H₂O。