[发明专利]德国小蠊击倒抗性相关突变基因、蛋白及鉴定引物和鉴定方法

说明书

本发明公开了德国小蠊击倒抗性相关突变基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。并公开了其蛋白及鉴定引物和鉴定方法。本发明以一对引物扩增德国小蠊相关抗性基因突变的基因片段并进行测序，通过四引物ARMS‑PCR法鉴定德国小蠊抗性基因。本发明可以广泛应用于德国小蠊抗性基因突变的鉴定需求及相应的科研领域。

技术领域

本发明涉及一种德国小蠊击倒抗性相关突变基因、蛋白及鉴定引物和鉴定方法，属于生物技术领域。

背景技术

德国小蠊是分布最广泛，也是最难治理的一类世界性家居卫生害虫。德国小蠊的繁殖速度比一般蟑螂要快数千倍，在适宜条件下，一只雌虫一年可以繁殖4代左右，经过半个月左右其虫卵即可孵化成长为成虫，群体数量比一般蟑螂多几倍乃至几千倍。德国小蠊的生活习性与一般蟑螂相似，喜在宾馆、酒店的中西厨房、酒吧、餐厅、包房等场所活动。与蟑螂的危害相类似，德国小蠊会损坏食品、家具、纺织衣物、纸张等日常生活用品，并且在活动其间会将大量有害物质及致病病原传播到人们的食品及用具中，对人们的生命健康造成危害。当人类接触其污染过的食品以及生活用品后，还可能引发人体感染过敏、诱发哮喘和过敏性鼻炎等。除此之外，德国小蠊能够携带多种病原微生物，包括伤寒杆菌、痢疾杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、霉菌病毒以及寄生虫卵等，可以造成各种传染病的流行。为了降低德国小蠊给人们生活工作和身体健康带来的影响与危害，目前国内外均主要采用各类化学杀虫剂对其进行杀灭，然而由于杀虫剂的滥用和误用以及德国小蠊较快的生活世代，造成德国小蠊抗药性的问题日益严重。

研究表明德国小蠊对氯氰菊酯、胺菊酯、氯菊酯、右旋反式氯丙炔菊酯等均产生了不同程度抗性。为了深入认识其抗性的产生机理并指导杀虫剂的合理使用，因此开展关于德国小蠊抗药性机理的研究。针对德国小蠊的抗性机理研究表明，其抗药性产生的机理主要可分为四类，行为抗性、靶标抗性、代谢抗性和表皮穿透速率降低。昆虫的钠离子通道基因点突变导致了靶标抗性，是德国小蠊对菊酯类杀虫剂产生抗性的最重要机制，会带来较强的抗性，且与抗性表型连锁，因此监测突变基因的频率可以监测抗性表型。我们在实验室内通过药膜接触法筛选出了具有抗性表型的德国小蠊，并扩增了其钠离子通道基因片段，测序后将得到的核酸序列与德国小蠊敏感品系的相应序列进行比对,发现在其钠离子通道ⅡS4-ⅡS6结构域的1059位密码子存在突变, 由GAT突变为AAA，导致该位点氨基酸由天冬氨酸突变为赖氨酸，表明该品系的抗性表型可能与击倒抗性(kdr)有关。本实验建立一种四引物ARMS-PCR 检测技术，针对该抗性突变(D1059K)，检测该突变的存在与否。四引物扩增抗拒突变系统PCR(四引物ARMS-PCR)是一种简便快捷的检测方法，其原理是利用引物3’末端碱基互补性来控制引物的延伸，针对目标碱基突变位点设计一对延伸方向相反的内因物，使其3’末端碱基正好位于突变位点，并分别与该位点的两种基因型互补，再搭配一对延伸方向相对的外引物(包含突变位点且两条引物距离突变位点的距离差距足够大)，将两对引物按恰当比例混合后加入同一扩增反应，根据扩增片段的琼脂糖凝胶电泳结果可直接判断突变位点的有无与突变状态。

发明内容

1、发明目的。

本发明提出了一种德国小蠊击倒抗性相关新型突变基因和蛋白的序列，以及相关的鉴定方法和鉴定引物。

2、本发明所采用的技术方案。

一种德国小蠊击倒抗性相关突变基因，德国小蠊的钠离子通道基因的 1059位密码子由GAT突变为AAA。

优选的，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

一种德国小蠊击倒抗性相关突变基因，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

通过测序比对发现第1059位密码子由GAT突变为AAA，导致该位点氨基酸由天冬氨酸突变为赖氨酸(D1059K)。

本发明公开了德国小蠊击倒抗性相关突变基因的鉴定引物，包括如下四个引物：