[发明专利]蝙蝠源轮状病毒基因组及筛选引物、扩增引物和扩增方法

说明书

本发明公开了一种蝙蝠源轮状病毒基因组扩增和扩增方法及其应用，并公开了用于快速筛查蝙蝠源轮状病毒的引物对。本发明分别以4对引物作为扩增引物的上下游引物，以蝙蝠样本提取的轮状病毒RNA模板进行RT‑PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后在拼接比对得到蝙蝠源轮状病毒基因组部分节段序列。本发明针对蝙蝠源轮状病毒基因组特征和参考已知其他轮状病毒基因组序列，根据其基因组所包括的开放阅读框设计了分段扩增策略，并根据保守区域设计相应的扩增引物，能有效的扩增蝙蝠源轮状病毒全基因组序列。本发明可以广泛应用于蝙蝠源轮状病毒检测需求及相应的科研领域。

技术领域

本发明涉及一种蝙蝠源轮状病毒基因组及筛选引物、扩增引物和扩增方法，属于生物技术领域。

背景技术

蝙蝠群体数量庞大，是仅次于啮齿类的第二大类哺乳动物群(Patterson etal.1994)。蝙蝠携带的病原体种类较多，包括病毒、细菌和寄生虫等。目前，在蝙蝠体内已检测到60多种人畜共患病病毒，其中包含对人类高度致病的埃博拉病毒、狂犬病毒、马尔堡病毒和SARS样冠状病毒等。

轮状病毒属于呼肠病毒属轮状病毒科，是导致幼龄动物、禽类和婴幼儿腹泻的主要病原体。病毒粒子呈圆形，形似车轮辐条，无包膜，大小为65-75nm，由外层衣壳，内层衣壳和核心衣壳三层衣壳组成，核衣壳内包裹病毒核酸。基因组由11个独立节段的双链RNA构成，分别编码6个结构蛋白和5个非结构蛋白(NSP1-5)。由于轮状病毒基因组具有节段性的特点，当两株以上轮状病毒存在于同一个宿主时，极易发生轮状病毒片段之间的重组，从而产生重组病毒株。根据VP6蛋白的差异，轮状病毒可以分为A-G群，A群轮状病毒是感染人和其他哺乳动物最常见的血清型。2007年，Esona等首次在肯尼亚棕色果蝠体内检测到轮状病毒，扩大了轮状病毒的宿主范围。2012何彪等在中国云南的小菊头蝠体内检测到轮状病毒，利用Marc-145细胞成功分离到第一株蝙蝠源轮状病毒株MSHL14。此后，越来越多新的轮状病毒株在世界各地不同种类的蝙蝠体内被检出。

中国舟山群岛地处东南沿海地区，岛屿众多，气候湿热，是自然疫源性疾病的高发地带。本课题组前期在舟山地区蝙蝠检测到了博卡病毒、圆环病毒和SARS样冠状病毒。为了解该地区蝙蝠轮状病毒的流行和分布情况，设计针对轮状病毒特异性引物，筛选阳性标本，获取基因组序列后进行同源性分析和构建进化树，以确定病毒来源和基因差异程度，对研究蝙蝠源轮状病毒具有重要意义。

发明内容

1、发明目的。

本发明提出了一种具有高特异性和灵敏度的蝙蝠源轮状病毒基因组筛查及扩增方法。

2、本发明所采用的技术方案。

本发明公开了蝙蝠源轮状病毒基因组VP3，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明公开了蝙蝠源轮状病毒基因组VP6，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明公开了蝙蝠源轮状病毒基因组VP7，其DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还公开了一种用于快速筛查蝙蝠源轮状病毒的引物对1，其上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.5所示。应用引物对1对蝙蝠肠组织提取的cDNA进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳显示和目的条带大小一致的条带后，对应PCR产物送公司测序验证，验证序列blast比对为轮状病毒VP3序列，即证明对应的蝙蝠肠组织标本携带轮状病毒。具体筛查电泳图见图1。

上述引物对在快速筛查蝙蝠源轮状病毒中的应用。

本发明还公开了一种蝙蝠源轮状病毒基因组扩增引物对，其特征在于：包括以下4对引物：

引物对2:VP3F1:5’-GGCTATTAAAGCAGTATTAG-3’(SEQ ID NO.6)；