[发明专利]Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将Peptibody多表位疫苗发酵产物均质至澄清，然后将均质液超声破碎至不粘稠，得到破碎上清液；

(2)将步骤(1)的破碎上清进行阳离子交换层析，收集洗脱液Ⅰ；

(3)将步骤(2)的洗脱液Ⅰ进行疏水层析，收集洗脱液Ⅱ；

(4)将步骤(3)的洗脱液Ⅱ进行Protein A亲和层析，得到所述的Peptibody多表位疫苗纯化产物，即为本发明的终产物；

所述的Peptibody多表位疫苗为申请号为CN201711202680.5的中国专利申请所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗，其氨基酸序列如中国专利申请CN201711202680.5中的SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的超声使用1/2破头进行超声；

步骤(1)中所述的破碎上清液过膜后再进行步骤(2)的操作；

所述的分离纯化方法还包括浓缩步骤和/或替换缓冲液的步骤。

3.根据权利要求2所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的均质的单次破碎菌体为400g，菌液体积为800mL，工作压力为900bar，均质循环次数为7次；

步骤(1)中所述的超声的破碎条件为：冰浴，1/2破头，频率30％，工作5s、停5s，有效破碎时间30min；

所述的膜的孔径为0.22μm；

所述的浓缩和/或缓冲液替换步骤为超滤；

所述的缓冲液为0.015M PBS。

4.根据权利要求1所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的阳离子交换层析的填料为Capto^TMS ImpAct；

步骤(2)中所述的阳离子交换层析以PB-NaCl为洗脱体系，按照20mM的PB：1M NaCl(V:V)＝50:50、30:70、0:100进行梯度洗脱，收集30:70、0:100峰值洗脱液；洗脱流速为25mL/min；其中，所述的PB指磷酸缓冲液。

5.根据权利要求1所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的疏水层析的填料为Phenyl Sepharose HP；

步骤(3)中所述的疏水层析的洗脱体系为按20mM PB：NaCl(V:V)＝25:75、50:50、75:25、100:0和水进行梯度洗脱，收集各峰值洗脱液；洗脱流速为8mL/min；其中，所述的PB指磷酸缓冲液。

6.根据权利要求1或5所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的Protein A亲和层析的预装柱为HiTrap rProtein A FF；

步骤(4)中所述的Protein A亲和层析的洗脱为：先用10mM NaCl洗脱，再用20mM CB洗脱；洗脱流速为2mL/min；其中，所述的CB指枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。

7.根据权利要求6所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的疏水层析中上样的NaCl浓度范围为2～3M；

步骤(4)中所述的Protein A亲和层析中所述的20mM CB的pH范围为2.7～3.7。

8.根据权利要求7所述的抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的疏水层析中上样的NaCl的浓度为2M；

步骤(4)中所述的Protein A亲和层析中所述的20mM CB的pH为3.6。