[发明专利]Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法及其应用

说明书

本发明提供了Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法及其应用，对菌液进行均质和超声的前处理后，先利用阳离子交换层析进行粗纯，然后采用疏水层析进一步纯化，纯化后的产物再进行Protein A亲和层析，即得纯化后的Peptibody多表位疫苗的终产物。所述的分离纯化方法简单稳定，可有效、快速地处理大量样品，各纯化环节有机配合，纯化效率得到显著提高，操作简单，易于放大生产。通过所述的分离纯化方法，产物纯度达86％以上，Peptibody多表位疫苗的免疫原性好，能够有效引起机体产生特异性免疫应答，实现了抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的规模纯化，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程重组蛋白纯化技术领域，涉及Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法及其应用，特别涉及一种抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法及其应用。

背景技术

在bFGF和VEGF等细胞因子的共同作用下，不断生成的肿瘤血管能够为肿瘤细胞的发展提供氧气和营养物质，因此，bFGF和VEGF已经成为有效抑制肿瘤血管新生和肿瘤细胞发展的靶点分子。发明人团队前期成功构建含有三个bFGF、三个VEGF抗原优势表位和人IgG1Fc片段基因(Peptibody多表位疫苗)的pET28a质粒以及重组大肠杆菌Peptibody工程菌(BL21)，并成功建立了Peptibody工程菌的发酵生产工艺。在前述研究中，对Peptibody多表位疫苗也进行了纯化，但在将该纯化方法用于规模化纯化时，研究发现仍需至少对如下技术难点进行突破解决：

(1)菌体单次处理量较小。

(2)超声破碎无法实现大量菌体的快速破碎，难以获得适于进行蛋白纯化的样品。

(3)Protein A亲和层析是根据Protein A与IgG Fc具有极高亲和力的特点，对抗体和含IgG Fc的重组蛋白进行分离的纯化方法，特异性高，能够简单方便地获得高纯度蛋白。虽然Peptibody多表位疫苗含有Fc片段，可通过Protein A纯化蛋白，但工艺放大后大肠杆菌破碎上清存在大量菌体蛋白，严重影响Peptibody多表位疫苗与Protein A柱的结合；另外，Protein A填料价格十分昂贵，原有纯化方法成本高，难以实现规模化生产；同时，Peptibody多表位疫苗的最终设计是人用制剂(例如注射剂)，虽然诸如镍亲和层析等金属螯合填料的蛋白捕获量大，但是残留的镍离子对人体有潜在危害。

(4)规模化纯化中各纯化环节的配合有待进一步改善。

(5)纯化工艺效率及对纯化过程中目的蛋白的稳定性有待进一步提高。

因此，本发明对研究实践中所发现的技术问题开展了进一步的深入研究，以期实现Peptibody多表位疫苗规模化的分离纯化。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术纯化Peptibody多表位疫苗的缺点与不足，基于申请人的研究成果，本发明对Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法进行了进一步的创新研究与完善，对纯化方法工艺进行了放大和改进，提供了一种抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法；该分离纯化方法基于阳离子交换层析、疏水层析和Protein A亲和层析技术，能够实现规模纯化抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗。

本发明的另一目的在于提供所述的Peptibody多表位疫苗分离纯化方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)将Peptibody多表位疫苗发酵产物均质至澄清，以破碎大肠杆菌的细胞壁；然后将均质液超声破碎至不粘稠，以破碎大肠杆菌的DNA，得到破碎上清液；