[发明专利]一种圆叶丝粉藻原生质体的制备方法

权利要求书

1.一种圆叶丝粉藻原生质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：选取圆叶丝粉藻幼叶，用无菌海水清洗后暂养，得到原材料1；

S2：将S1中得到的原材料1放入预处理液中浸泡，得到原材料2；

S3：取出S2中得到的原材料2，吸干水分后切成块，加入酶液进行酶解，得到酶解组织，酶液pH值为5.0-6.0，酶解温度为23-27℃；

S4：将S3中得到的酶解组织过滤，得到过滤液；

S5：将S4中得到的过滤液离心，弃上清液，用W5溶液悬浮沉淀，离心，弃上清液，得到沉淀；

S6：将S5中得到的沉淀用MMG溶液悬浮，得到圆叶丝粉藻原生质体；

所述的步骤S1中暂养的条件为：温度20-25℃、光照强度800-1200 lx、光照时间8-12小时/天，暂养的时间为1-3天，培养基包括24.3 mg/L NaNO₃、3.75 mg/L KH₂PO₄；

所述的步骤S2中的预处理液包括：0.05-0.2 g/L磷脂酶和80-120 mmol/L EDTA；所述的浸泡时间为1-4小时；

所述的步骤S3中的酶液包括：1.0-2.0wt%纤维素酶R-10、0.3-0.8wt%果胶酶R-10、0.2-0.6 mol/L甘露醇、10-30 mmol/L KCl、10-30 mmol/L MES、5-15 mmol/L CaCl₂·2H₂O和0.05-0.2wt% BSA；

所述的步骤S3中的酶解条件为100-140 rmp摇床进行黑暗酶解6-12小时。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S2中的预处理液包括：0.1g/L磷脂酶和100 mmol/L EDTA；所述的浸泡的时间为2小时。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S3中的酶液包括：1.5wt%纤维素酶R-10、0.5wt%果胶酶R-10、0.4 mol/L甘露醇、20 mmol/L KCl、20 mmol/L MES、10mmol/L CaCl₂·2H₂O和0.1wt% BSA，pH值为5.5。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S5中的W5溶液包括：9 g/LNaCl、18.4 g/L CaCl₂·2H₂O、0.37 g/L KCl和0.3 g/L MES；所述的步骤S5中的离心速度为70×g，离心时间为5 min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S6中的MMG溶液包括：1.42g/L MgCl₂、1.0 g/L MES和73 g/L甘露醇。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的制备方法制备的圆叶丝粉藻原生质体在细胞融合中应用。