[发明专利]一种圆叶丝粉藻原生质体的制备方法

说明书

本发明公开了一种圆叶丝粉藻原生质体的制备方法，属于植物细胞工程领域。该制备方法包括以下步骤：S1：取圆叶丝粉藻幼叶，用无菌海水清洗后暂养，得到原材料1；S2：将S1中得到的原材料1放入预处理液中浸泡，得到原材料2；S3：取出S2中得到的原材料2，吸干水分后切成块，加入酶液进行酶解，得到酶解组织；S4：将S3中得到的酶解组织过滤，得到过滤液；S5：将S4中得到的过滤液离心，弃上清液，用W5溶液悬浮沉淀，离心，弃上清液，得到沉淀；S6：将S5中得到的沉淀用MMG溶液悬浮，得到圆叶丝粉藻原生质体。本发明首次建立了圆叶丝粉藻原生质体的制备方法，该方法获得的圆叶丝粉藻原生质体产量高、存活率高。

技术领域

本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种圆叶丝粉藻原生质体的制备方法。

背景技术

海草是一种生活在热带和温带海域浅海中的单子叶大型沉水植物，属于沼生目。它们具有高等植物的一般特征，能够在水中完成生活史。海草的初级生产力很高，是浅海水域生态系统——海草场的重要组成。海草场资源独特，其生态经济价值主要表现在：(1)海草可以加快海水中的悬浮物的沉降、吸收海水中的营养盐和重金属等，进而改善水质；(2)海草通过减缓水流，进而增加水中悬浮物的沉降，达到稳定底质的效果；(3)海草场为众多海洋生物供庇护场所、栖息地、育幼以及觅食场所；(4)海草场能够维持全球碳、氮、磷平衡；(5)海草是提炼碘、铁、钙、氯化钾等物质的廉价原料。

我国的海草分布可分为北方海域海草分布区和南方海域海草分布区。北方海域分布区包括辽宁、河北、天津和山东等省市沿海，约含有3属9种3属9种；南方海域分布区包括海南省、广西壮族自治区、广东省、香港特别行政区、台湾省和福建省沿海，约含有9属15种。海南是中国海草场分布面积最大的省份，占我国海草总面积的64％，且主要集中于东部沿岸，如文昌、琼海、陵水、三亚。其中，陵水黎安港以圆叶丝粉藻作为优势种。近年来，受自然因素和人类活动干扰的影响，我国海草场迅速缩减，许多优质海草资源受到严重破坏、繁殖率降低。

原生质体是植物细胞中除细胞壁以外的被细胞膜包围的“裸露细胞”，能够长成一个完整的植株个体，具有胚性。可应用于构建细胞融合、克服有性杂交障碍、培育植物新品种。另外，原生质体为植物学研究、作物遗传改良和种质资源保存提供了极为有利的试验材料。目前，已有通过酶解法从海草中分离出原生质体的报道。比如，崔翠菊等人使用浓度为20g/L的纤维素酶和浓度为5g/L果胶酶分离得到大叶藻原生质体(大叶藻原生质体的分离和培养.水产科学,2014,33(8),508-511.)；Baleststri E等人使用1w/v％纤维素酶、0.5w/v％半纤维素酶和1w/v％果胶酶分离得到大洋聚伞藻和海神草(Isolation and cell wallregeneration of protoplasts from Posidonia oceanica and Cymodoceanodosa.Aquatic Botany,2001(70),237–242.)。但是，目前公开的资料中未见有针对圆叶丝粉藻原生质体制备方面的研究。此外，由于不同海草细胞壁中成分、含量的差异以及诸多因素影响植物原生质体的制备和活力，利用现有方法制备得到的圆叶丝粉藻原生质体产量不理想、存活率较低。

因此，需要探索一种高效降解圆叶丝粉藻细胞壁、制备原生质体的方法。

发明内容

针对现有技术中暂无有关圆叶丝粉藻原生质体制备方法的问题，本发明提供了一种圆叶丝粉藻原生质体的制备方法。

本发明提供的圆叶丝粉藻原生质体的制备方法，包括以下步骤：

S1：选取圆叶丝粉藻幼叶，用无菌海水清洗后暂养，得到原材料1；

S2：将S1中得到的原材料1放入预处理液中浸泡，得到原材料2；

S3：取出S2中得到的原材料2，吸干水分后切成块，加入酶液进行酶解，得到酶解组织；

S4：将S3中得到的酶解组织过滤，得到过滤液；