[发明专利]基于靶标激发金纳米粒子表面DNA循环的蛋白质荧光分析方法

说明书

本发明涉及一种基于靶标激发金纳米粒子表面DNA循环的蛋白质荧光分析方法。该分析方法的检测溶液包括修饰发卡DNA1的金纳米粒子Au‑DNA1、双链DNA识别探针DNA2/DNA3、单链DNA识别探针DNA4和核酸内切酶Nt.BbvCI。DNA1上标记有荧光染料，此荧光染料的荧光被金纳米粒子猝灭。当靶标蛋白存在时，可被识别探针夹心识别，基于邻位效应，DNA4取代DNA2与DNA3杂交，释放的DNA2与Au‑DNA1杂交，激活酶切位点，引发Nt.BbvCI对DNA1的酶切，使得荧光染料远离金纳米粒子表面恢复荧光，此酶切反应可在金纳米粒子表面循环进行，从而放大荧光信号，实现对靶标蛋白的灵敏定量分析。该分析方法操作简单、灵敏、普适性高，具有一定的临床应用价值。

一、技术领域

本发明为一种基于靶标激发金纳米粒子表面DNA循环的蛋白质荧光分析方法，用于对蛋白质分子的简单、灵敏检测。通过蛋白-适配体识别模式，利用夹心识别反应产生邻位效应，诱导核酸杂交、链取代、金纳米粒子表面DNA酶切循环放大，使得大量荧光染料释放，放大荧光信号，实现对靶标蛋白的灵敏定量分析。

二、背景技术

细胞分泌物的表达异常与包括恶性肿瘤在内的多种疾病相关，因此具有重要的分析检测意义。常规细胞分泌物检测方法主要包括基于抗原抗体识别的免疫分析和基于蛋白-适配体识别的分析方法。免疫分析方法主要为酶联免疫法(ELISA)，该方法虽具有较高的检测灵敏度，但其存在操作复杂、耗时长、成本高等缺点。不同于蛋白抗体，适配体是一条能特异性识别目标蛋白的短链核酸序列，因其具有稳定性强、易合成和功能化、成本低廉、操作简单、循环方式多样等优点，已被广泛用于蛋白质的检测。然而目前基于蛋白-适配体识别所建立的细胞分泌物(例如PDGF-BB)的检测方法，主要依赖适配体与目标蛋白识别后其结构的改变直接产生信号进行检测。这些方法由于缺乏可靠的信号放大步骤，检测灵敏度不高。因此，迫切需要发展简单、快速、灵敏的细胞分泌物检测方法。

邻位诱导效应通过夹心识别反应使一对含有DNA的亲和探针(如抗体-DNA复合物，DNA-适配体序列)与靶标蛋白结合形成邻位复合物，使得亲和探针上的DNA 产生邻位杂交，进而触发级联DNA循环反应，产生检测信号。该策略将对蛋白质的检测转化为对DNA的检测，由于DNA放大技术成熟并多样，通过与各种DNA信号放大技术偶联，可实现对蛋白质的灵敏检测。

3维DNA分子机器构建于纳米或微米颗粒表面，主要包括驱动核酸链和DNA运动轨道。其中，运动轨道由纳微米颗粒表面高密度修饰的核酸链构成。这种高密度的修饰极大的提高了核酸的局域浓度，使得杂交反应能高效率的循环进行。驱动核酸链存在时可通过DNA杂交反应在熵驱动或酶驱动模式下在运动轨道上行走，实现信号放大。现今已发展了多种3维DNA分子机器，并用于发展高灵敏的生物分析方法。

本发明结合蛋白-适配体夹心识别反应、邻位诱导效应、3维DNA分子机器放大技术，设计了一个基于靶标蛋白激发金纳米粒子表面DNA循环放大的蛋白质荧光分 析方法，并用于对细胞分泌物的灵敏检测。该方法简单、灵敏、通用，在临床分析中 有较大的应用前景。

三、发明内容

本发明的内容是：制备高密度修饰发卡DNA1的金纳米粒子Au-DNA1，结合邻位效应、DNA链取代反应、酶切循环放大技术，发展了一种靶标蛋白激发金纳米粒子表面DNA循环放大的蛋白质荧光分析方法，实现了靶标蛋白的简单、快速、灵敏检测。

本发明通过以下技术方案来实现：