[发明专利]基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法及应用

权利要求书

1.CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，所述试剂的制备过程如下：

1）制备RPA产物：以EBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH₂O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到RPA产物；

2）制备PS2.M/Hemin溶液：PS2.M DNA溶解在Tris-HCl溶液，向溶液中加入Hemin溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；

3）制备Cas12a/crRNA复合物溶液：将FnCas12a和EBV crRNA加入到Tris-HCl缓冲液中，孵育，制得Cas12a/crRNA复合物溶液；

4）检测EBV：将RPA产物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA复合物溶液孵育，加入ABTS和H₂O₂处理后测定吸光度。

2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，步骤1）中，所述DNA提取采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒进行提取；

所述扩增引物对包括RPA引物对1、

RPA-1上游引物: 5' CACCTTCATCACCGTCGCTGACTCCGCCATC3'，序列如SEQ ID NO.4所示；

RPA-1下游引物: 5' GCGACCGGTGCCTTCTTAGGAGCTGTCCGAG3'；序列如SEQ ID NO.5所示；

或RPA引物对2

RPA-2上游引物: 5' ATTTCTGGTCGCATCAGAGCGCCAGGAGTC3'，序列如SEQ ID NO.6所示；

RPA-2下游引物：5' GCAAGACGAGGGAGGGAAGGGGAAAAGTTAGA3'，序列如SEQ ID NO.7所示；

所述孵育过程如下：37℃水浴锅中孵育20min。

3.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，所述Tris-HCl溶液的浓度为20mmol/L，pH7.5，含100 mmol/L KCl、40mmol/L MgCl₂、0.008% Triton X-100；所述Hemin溶液由Hemin用DMSO配制成。

4.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，所述FnCas12a的制备过程如下：使用化学合成法进行FnCas12基因合成，并将FnCas12克隆入PET-32a原核表达载体中；经Sanger法测序鉴定插入序列正确后，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli. BL21；用IPTG诱导表达6His-TRX-TCRP1融合蛋白，进行亲和层析纯化融和蛋白；用EK酶切去除融合蛋白6His标签，并纯化鉴定FnCas12蛋白。

5.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，所述EBV crRNA的制备过程如下：合成正义链序列、反义链序列；将二者经退火形成双链DNA；经T7 polymerase体外转录成crRNA，并使用亲和层析纯化得到EBVcrRNA；

所述正义链序列为

5’TAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATCTGCTAAGCCCAACACTCCA3’；

所述反义链序列为

5’ TGGAGTGTTGGGCTTAGCAGATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA 3’；

所述EBV crRNA序列为

5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUGCUAAGCCCAACACUCCA3’。