[发明专利]基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法及应用

说明书

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas12a和G四链体‑血红素的EBV的检测方法及应用，过程如下：以EBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH₂O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到PRA产物；PS2.M DNA溶解在Tris‑HCL溶液，向溶液中加入Hemin溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；将FnCas12a和EBV crRNA加入到Tris‑HCl缓冲液中，孵育，制得Cas12a/crRNA复合物溶液；将RPA产物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA复合物溶液孵育，加入ABTS和H₂O₂处理后测定吸光度。本发明是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法及应用。

背景技术

B病毒(Epstein-Barrvirus；EBV)属于疱疹病毒家族，主要侵犯B淋巴细胞，引起传染性单核细胞增多症，并与多种淋巴瘤的发生有密切关系。EBV在人群中广泛感染，约90％以上的成人血清EBV抗体呈阳性。

生理状态下，在机体免疫系统作用下，EBV再激活和EBV特异CD8+T细胞的抗病毒免疫控制处于一种平衡状态，使EBV处于未活化状态而长期潜伏在人体淋巴组织中，受感染者终生携带病毒而不发病。以往EBV检测方法主要包括采用免疫酶染色法或免疫荧光技术检测血清中EBV特异性抗体，以及核酸杂交和PCR等方法检测细胞内EBV基因组及其表达产物。但是常规PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，且耗时较长，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。与传统PCR相比，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-meraseamplification，RPA)一种新型的恒温核酸扩增技术，其最显著的优势就是可在37-42℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，可以在10～40min内完成数十亿的DNA拷贝。RPA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应，无需精密仪器。

CRISPR-Cas是细菌抵抗病毒和质粒侵染的获得性免疫防御系统，几乎存在于所有的古菌和约50％的现代细菌。CRISPR-Cas平台是出色的基因组编辑工具，其层出不穷的科研进展及其应用更新给生物学界带来巨大革命。CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR系统要由多个Cas蛋白组成的效应复合物才能发挥功能；第二大类Cas是依靠单个Cas效应蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2等)就能发挥功能。

2015年，张锋等人发现了新的CRISPR相关蛋白内切酶Cas12a(之前称为Cpf1)，它与常用的Cas9蛋白一样是RNA引导的特异性DNA核酸内切酶，但与相比Cas9，Cas12a又有它自身特点，比如仅需要crRNA即可引导特异性切割双链DNA，并产生粘性末端等。Cas12a一旦识别并切割由crRNA序列指定的靶标DNA，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它能将任意非靶标的单链DNA切成碎片。这种作用称之为附属活性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法及应用，通过采用重组酶聚合酶扩增技术提高检测灵敏度，且是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。

为解决上述问题，

一方面，本发明在于提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法，包括如下步骤：

1)制备RPA产物：以EBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH₂O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到RPA产物；