[发明专利]一种抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法及应用

权利要求书

1.一种抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)致病菌的分离鉴定；

(2)菌毛基因鉴定筛选；

(3)菌毛抗原提取纯化；

(4)卵黄无菌分离；

(5)抗体纯化。

2.根据权利要求1所述的抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的致病菌的分离鉴定具体步骤为：

(a)将采集的犊牛腹泻粪便分别接种于普通琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上，放在37℃恒温培养箱连续培养24h，选择单菌落进行染色镜检，然后进行纯化培养；

(b)选取分离获得的犊牛致病性大肠杆菌菌株，分别接种营养肉汤培基培养，制备含菌量为10⁹CFU/mL的悬浮液后腹腔接种小鼠体内，每只小鼠接种0.2mL，共5只，再做一组空白对照组小鼠接种无菌营养肉汤，每只小鼠接种0.2mL，共5只，接种后隔离饲养观察5d，记录小鼠死亡情况。

3.根据权利要求1所述的抗犊牛大肠杆菌F41菌毛抗原高免卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的菌毛基因鉴定筛选的具体步骤为：取步骤(1)鉴定好的菌株接种至5mL LB液体培养基中，置于恒温摇床37℃培养24h；取培养好的菌液1.5mL至离心管中，14000r/min离心10min；离心后弃上清液，向沉淀加入15μL溶菌酶，所述的溶菌酶的浓度为50mg/mL，300μLTE缓冲液吹打菌泥沉淀至混匀，37℃水浴1h；加入50μL 10％SDS、10μL蛋白酶K，置于振荡器中混合均匀，所述的蛋白酶K的浓度为20mg/mL，60℃水浴2h，并每隔5min上下颠倒混匀；加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液；所述的酚/氯仿/异戊醇混合液的混合体积比为25:24:1，置于振荡器中混匀，14000r/min离心15min，取上清液置于新的离心管中；加入等体积氯仿/异戊醇，洗脱饱和酚，14000r/min离心10min；再加入10：1体积乙酸钠，2:1体积无水乙醇，置于摇床中1h；取出后14000r/min离心10min，弃上清，用预冷的75％酒精洗下沉淀，14000r/min再次离心10min，弃上清，室温下晾干离心管内酒精为止；向沉淀中加入50μLTE缓冲液，混合均匀后置于-20℃保存备用；

F41 PCR引物序列如下表所示：

PCR反应体系：

2]]>	2μL
RxnBuffer	2μL
上引物	1μL
下引物	1μL
Taq酶	1μL
大肠杆菌DNA模板	2μL
总计	2O补齐30μL]]>

以提取的大肠杆菌DNA为模板，进行PCR反应，反应条件为：在95℃预变性10min，再变性35s，在57℃退火35s后72℃延伸35s，如此循环35次，在72℃延伸10min；反应结束后将PCR产物在2％琼脂糖凝胶下90V电泳30min后，EB染色15min，紫外线下观察结果，获得菌毛基因。