[发明专利]一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤一，采集脂肪；步骤二，脂肪除杂；步骤三，混酶消化；步骤四，收集离心；步骤五，培养传代；步骤六，消化冻存；其特征在于：

其中在上述步骤一中，采集脂肪包括以下步骤：

1）采集人来源的脂肪2-100ml，放入无菌储存运输液中；

2）将采集的脂肪，消毒，清洗；

其中在上述步骤二中，将消毒清洗后的脂肪组织，放入离心管中用眼科剪剪碎组织，加入4~10倍体积生理盐水，1500-2000rpm离心5min离心后，将上层脂肪块吸取至离心管中加入生理盐水，再次洗涤离心；

其中在上述步骤三中，混酶消化包括以下步骤：

1）将上述步骤二中所得的脂肪组织中加入等体积的混合酶； 2）利用2ml移液器吹打分散脂肪团块，放入恒温恒湿CO2培养箱中，消化10-30min；

其中在上述步骤四中，将上述步骤三中所得脂肪组织收集并离心，得到细胞沉淀；

其中在上述步骤五中，无血清培养包括以下步骤：

1）利用红细胞裂解液破解红细胞，离心后得到白色细胞沉淀；

2）用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿CO₂培养箱中；

3）24-40H后，可观察到大约20-40%融合的长梭形贴壁细胞时换液；

4）培养至第三天或第四天，细胞达到90%以上融合时，采用TrypLE™ Express进行消化；

5）将所得的细胞按照1:3~1:8的比例进行传代，用无血清体系培养；

其中在上述步骤六中，当培养的细胞达到90%以上融合时再采用TrypLE™ Express进行消化后冻存。

2.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤一1）中，人来源的脂肪可以是腹部脂肪块，大腿脂肪块，或者是抽脂的脂肪悬液。

3.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤一1）中，人来源的脂肪采集后放入无菌储存运输液中储存运输的温度为4~20℃。

4.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤一1）中，人来源的脂肪采集后12~24小时内运输至实验室进行分离处理。

5.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤一2）中，消毒清洗的方法为，将脂肪组织放入75%的酒精中浸泡2~3s，加入1~5倍量的生理盐水洗涤，离心后用止血钳将脂肪转移至离心管加入4~10倍体积生理盐水，颠倒混匀数次离心，重复2-3次。

6.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤三1）中，消化脂肪的混合酶配方为基础培养基添加0.05~0.25% 的胶原酶CollagenaseTypeⅠ、0.05~0.25% 的胶原酶Collagenase TypeⅣ和5~10%的TrypLE™ Express。

7.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤三1）中，细胞在接种前接种的培养皿需要用5~25ug/cm²的纤维连接蛋白铺皿30min以上。

8.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤三2）中，脂肪消化10~30min后，用2ml移液器或者1ml移液枪反复吹散脂肪团块，再继续消化。

9.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤五2）中，无血清培养体系配方为：低糖的DMEM/F12添加5-30%HPL，5~50ng/mlbFGF。