[发明专利]一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤一，采集脂肪；步骤二，脂肪除杂；步骤三，混酶消化；步骤四，收集离心；步骤五，培养传代；步骤六，消化冻存；该人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，采用混合酶分离，消化时间短，所得到的细胞不需要淋巴细胞分离液和过滤网的进一步纯化，只需在细胞贴壁之后换液即可，此方法分离过程成本低；分离操作，所使用的试剂物料少，操作流程简化，减少操作过程中的污染风险；整个分离和培养过程中均无使用动物源血清，降低细胞毒性；采用的混合酶和无血清培养体系的组成及配方使得培养周期短。

技术领域

本发明涉及脂肪间充质干细胞技术领域，具体为一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法。

背景技术

脂肪间充质干细胞，又叫脂肪干细胞，是一种成体干细胞。研究证明，人脂肪来源、脐带来源、胎盘来源、骨髓来源的间充质干细胞均具有自我更新和多向分化潜能，在一定的诱导培养条件下能够分化成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，上皮细胞等，且具有免疫调节作用。脂肪间充质干细胞分化成脂肪细胞的能力强于其他组织来源的间充质干细胞，脂肪间充质干细胞在美容抗衰老方面具有显著的优势。

脂肪间充质干细胞是成体干细胞库的一重要成员，现有的分离技术存在一定的缺陷。传统的分离培养方法是将脂肪与消化酶混合之后放入摇床消化或者是加入一些活性添加剂，这使得分离过程的成本增高、对细胞产生机械损伤，繁琐的操作步骤也增加了污染的风险；此外，该分离方法导致所分离出来的细胞质量差，培养周期长，细胞易老化等风险；再者，以含动物源成分的培养体系进行扩增培养具有动物源性污染的风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤一，采集脂肪；步骤二，脂肪除杂；步骤三，混酶消化；步骤四，收集离心；步骤五，培养传代；步骤六，消化冻存；

其中在上述步骤一中，采集脂肪包括以下步骤：

1）采集人来源的脂肪2-100ml，放入无菌储存运输液中；

2）将采集的脂肪，消毒，清洗；

其中在上述步骤二中，将消毒清洗后的脂肪组织，放入离心管中用眼科剪剪碎组织，加入4~10倍体积生理盐水，1500-2000rpm离心5min离心后，将上层脂肪块吸取至离心管中加入生理盐水，再次洗涤离心；

其中在上述步骤三中，混酶消化包括以下步骤：

1）将上述步骤二中所得的脂肪组织中加入等体积的混合酶；

2）利用2ml移液器吹打分散脂肪团块，放入恒温恒湿CO2培养箱中，消化10-30min；

其中在上述步骤四中，将上述步骤三中所得脂肪组织收集并离心，得到细胞沉淀；

其中在上述步骤五中，无血清培养包括以下步骤：

1）利用红细胞裂解液破解红细胞，离心后得到白色细胞沉淀；

2）用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿CO₂培养箱中；

3）24-40H后，可观察到大约20-40%融合的长梭形贴壁细胞时换液；

4）培养至第三天或第四天，细胞达到90%以上融合时，采用TrypLE™ Express进行消化；

5）将所得的细胞按照1:3~1:8的比例进行传代，用无血清体系培养；

其中在上述步骤六中，当培养的细胞达到90%以上融合时再采用TrypLE™ Express进行消化后冻存。