[发明专利]一种胶质瘤预后标志物CPVL抑制剂及其应用

权利要求书

1.一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂，其靶核酸序列如下：GGATTTATACAGTGCACTA。

2.一种包含有权利要求1所述的抑制剂的试剂盒。

3.根据权利要求1所述的一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂在制备治疗胶质瘤药物中的应用，包含以下步骤，其步骤如下：

S1:检测CPVL基因在胶质瘤细胞株的表达；

将胶质瘤细胞株铺于细胞6孔板，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，待细胞长满，提取各细胞的总RNA，应用real-timePCR技术对不同胶质瘤细胞的CPVL基因进行检测；同时提取各细胞的总蛋白，利用Western Blot技术对不同胶质瘤细胞中CPVL基因表达的蛋白进行检测；

S2:对胶质瘤标本进行CPVL蛋白表达的检测和分析；

提取胶质瘤标本的总RNA，应用real-timePCR技术对人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的CPVL基因进行检测；然后提取组织标本的总蛋白，利用Western Blot技术对胶质瘤组织CPVL基因表达的蛋白进行检测；

将胶质瘤标本石蜡包埋，冰冻切片，运用免疫组化技术观察CPVL基因在胶质瘤标本中的分布情况；并进一步比较CPVL基因表达分布情况与胶质瘤病理分期分级的相关性；

结合临床生存期随访数据，以患者直接或间接因胶质瘤疾病“死亡”作为终点事件，计算3年累计生存概率；根据各标本CPVL基因的real-timePCR表达量数据将标本分为高表达组和低表达组，以回访时间作为x轴以累计概率作为y轴绘制生存曲线，分析CPVL基因表达与胶质瘤患者临床预后的相关性；

S3:对样品胶质瘤细胞进行感染

对CPVL基因表达高的胶质瘤细胞株进行慢病毒感染；

S4:将S3感染后的胶质瘤细胞进行克隆形成实验；

将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；以每孔100、200、300个细胞的梯度密度分别接种于3个细胞6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀；置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养14天后，经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去上清液，用PBS清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟；然后去固定液，加适量结晶紫染色液染色15分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；观察染色和克隆大小，计数并计算克隆形成率；

S5:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞增殖实验

运用MTT法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96孔板，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，另外设6个只有100μl完全培养基的空白孔做基准值；实验开始时共铺5块板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；自培养第二天开始，每天用MTT法检测一块板；MTT检测方法：培养终止前4h加入20μL 5mg/mL的MTT于孔中，无需换液；4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μLDMSO溶解甲瓒颗粒；振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测OD值；

运用Celigo细胞计数法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96孔板，每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，置于37℃、5％CO2培养箱培养；从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天；通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线；

S6:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞周期实验

运用PI-FACS法检测细胞周期，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板，待细胞贴壁后饥饿处理14h后加入完全培养基培养，待细胞进入对数生长期；胰酶消化，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS重悬，再次离心弃上清，共2次；加入预冷70％乙醇，固定3小时；离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500μl PBS含50μg/mL溴化乙锭，100μg/mL RNase A，0.2％Triton X-100，4℃避光孵育30分钟；以标准程序用流式细胞仪检测；

S7:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞凋亡实验

运用Annexin V-APC单染法检测细胞凋亡，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板；待细胞生长状态良好，胰酶消化，离心；在室温下用PBS洗涤；用500μl binding buffer重悬细胞，加入10μl Annexin-V medium buffer及1μl Annexin V荧光抗体，常温避光孵育15min后离心；用PBS洗涤后，500μl binding buffer重悬细胞，在1h内用流式细胞术检测并进行数据分析；

S8:采用回复实验验证CPVL基因调控机制

在胶质瘤细胞中沉默CPVL基因，然后使用STAT1抑制剂抑制STAT1基因的表达，利用S3、S4、S5、S6和S7的步骤进行试验，并记录检测后的细胞增殖数据。

4.根据权利要求3所述一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂在制备治疗胶质瘤药物中的应用，其特征在于，所述胶质瘤细胞为U87MG、U251、LN382其中的任意一组。