[发明专利]一种用于猪胰岛细胞的冻存复苏方法及冻存液和复苏液

权利要求书

1.一种猪胰岛细胞团微胶囊的冻存-复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备胰岛细胞团微胶囊；

具体包括如下步骤：

1）将胰岛细胞团和海藻酸钠溶液混合制备微胶囊，混合液中胰岛细胞团浓度为5000-10000IEQ/mL，海藻酸钠浓度为0.5-10%；

2）将胰岛细胞团微胶囊在50mM-200mM的氯化钙溶液中平衡至少30分钟后进行冻存;

（2）采用冻存液对胰岛细胞团微胶囊进行冻存，所述的冻存液包括A液、B液，组成如下：A液为低浓度冻存液，含二甲基亚砜0.5-1.5M，乙二醇0.1-1M，过氧化氢酶10-100μg/mL，海藻糖0.1-1M，β-氨基乙磺酸1-10mM，猪血清30-80%体积百分比；B液为高浓度冻存液，含二甲基亚砜2.5-4.5M，乙二醇0.1-1M，过氧化氢酶10-100μg/mL，海藻糖0.1-1M，β-氨基乙磺酸1-10mM，猪血清30%-80%体积百分比；

具体是将步骤（1）制备的胰岛细胞团微胶囊静置沉淀，弃上清；向弃尽上清的胰岛细胞团微胶囊中加入A液后平衡，再加入B液平衡；将胰岛细胞团微胶囊分装至冻存管中；分阶段降温后将细胞置于液氮中长期保存；

（3）采用复苏液对冻存的胰岛细胞团微胶囊进行复苏，所述的复苏液包括C液、D液，组成如下：C液为复苏平衡液，含蔗糖0.75-1.50M，过氧化氢酶10-100μg/mL，β-氨基乙磺酸1-10mM，SD282 0.1-5mM，5-30%体积百分比人血白蛋白；D液为倍比稀释液，含过氧化氢酶10-100μg/mL，β-氨基乙磺酸1-10mM，SD282 0.1-3mM，人血白蛋白5-30%体积百分比，乳酸醛酸盐10-100mM；

具体是在37°C快速溶解胰岛细胞团微胶囊，静置沉淀，弃冻存液上清；添加复苏平衡液C液平衡；再加入倍比稀释液D液平衡；静置沉淀，弃上清，加培养基培养。

2.根据权利要求1所述的猪胰岛细胞团微胶囊的冻存-复苏方法，其特征在于，步骤（2）具体如下：

1）将步骤（1）制备的胰岛细胞团微胶囊静置沉淀，弃上清；

2）向弃尽上清的胰岛细胞团微胶囊中加入A液，置于0~10°C，平衡至少30分钟；

3）加入等体积B液，混匀后置于-20~4°C，平衡至少20分钟；

4）将胰岛细胞团微胶囊按5000-10000IEQ/mL的量分装至预冷的冻存管中；5）以1~5°C/min的降温速率，将温度降至-10~0℃，平衡至少10分钟；

6）以0.2~1°C/min的降温速率，将温度降至-60~-20°C，后将细胞置于液氮中长期保存。

3.根据权利要求2所述的猪胰岛细胞团微胶囊的冻存-复苏方法，其特征在于，步骤（2）中

步骤2）向弃尽上清的胰岛细胞团微胶囊中加入A液，置于4°C平衡至少30分钟；

步骤3）加入等体积B液，混匀后置于0°C平衡至少20分钟；

步骤5）以1°C/min的降温速率，将温度降至-7.5°C，平衡至少10分钟；

步骤6）以0.2°C/min的降温速率，将温度降至-40°C，后将细胞置于液氮中长期保存。

4.根据权利要求1所述的猪胰岛细胞团微胶囊的冻存-复苏方法，其特征在于，步骤（3）具体如下：

1）37°C快速溶解胰岛细胞团微胶囊，静置沉淀，弃冻存液；

2）添加1-5倍体积复苏平衡液C液， 4°C平衡至少30分钟；

3）加入等体积倍比稀释液D液， 4°C平衡至少10分钟，

4）步骤3）最少重复3次；

5）静置沉淀，弃上清，加培养基培养。